代谢学人

Cell Metabolism：WATCH OUT! 可变剪切剪出脂肪性肝炎

编辑 | 孟美瑶

校对 | 张婷

小编有话说

      近年来，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）及非酒精性脂肪肝炎（NASH）全球快速蔓延，却尚未有明确靶向与显著疗效的药物上市。近年来有研究表明，NAFLD的发病机制与RNA剪接机制的失调密切相关。目前已有研究表明，非酒精性脂肪性肝病肝组织中有病理性RNA选择性剪接因子（如SRSF3、SRSF10等）的表达，提示RNA选择性剪接在NAFLD/NASH中的关键病理作用。本研究首次揭示了死亡相关凋亡诱导蛋白激酶DRAK2通过RNA剪接因子SRSF6通路导致线粒体相关基因（包括mtDNA聚合酶POLγ2）的可变剪接异常，并且充分论证这种线粒体功能相关基因的可变剪接异常是非酒精性脂肪肝病发生发展的关键病理分子机制。那么具体的研究是如何开展的呢，让我们一探究竟吧。

背景介绍

       大多数真核pre-mRNA包含非编码序列（内含子），需要通过RNA可变剪接过程去除这些内含子序列，将外显子序列正确地连接在一起，形成一个完整的基因编码序列。RNA可变剪接过程需要剪接体的参与，剪接体作为一种复杂的蛋白复合体，需要准确地识别内含子-外显子交界处特定的核苷酸序列，才能进行内含子切除和外显子连接。剪接体由5种snRNP和许多辅助蛋白组成，能够识别内含子上以GU开始的5’供体剪接位点，以AG结束的3’受体剪接位点，以及在3’受体位点之前的分支序列。5’剪接位点被U1 snRNP识别，而分支序列和3’受体剪接位点被U2 snRNP和辅助因子U2AF识别并结合。随后在U4、U5和U6 snRNPs的结合下，形成具有催化活性的剪接体复合物，进行反酯化反应，使mRNA链断裂以及再连接。RNA可变剪接异常与许多疾病有关。有研究发现肥胖和脂肪肝患者的肝脏中表现出剪接体蛋白功能发生紊乱，研究人员在体外沉默某些剪接体蛋白如PTBP1，RBM45可减少肝脏中脂质的积累，并调节脂肪生成关键酶的表达；也有研究发现，在NAFLD和NASH小鼠模型中RNA剪接因子SRSF3表达下降，其机制是由脂质积累诱导的氧化应激导致泛素样蛋白NEDD8与SRSF3结合，促使SRSF3被蛋白酶体降解，从而使RNA剪接模式发生异常，推动了NAFLD/NASH的发展。

      DRAK2（死亡相关凋亡诱导蛋白激酶2）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于死亡相关蛋白激酶家族的一员，是细胞凋亡的正向调节因子。有研究报道炎症细胞因子和游离脂肪酸会在胰岛β细胞中快速诱导DRAK2表达，DRAK2通过磷酸化 p70 S6 激酶，诱导胰岛细胞凋亡。DRAK2也被发现在肝细胞癌 (HCC) 中上调，并在体外和体内促进 HCC 细胞增殖和转移，机制上DRAK2通过激活AKT/GSK-3β/Snail信号通路促进上皮间充质转化（EMT）过程，高水平的DRAK2和低水平的miR-455-3p（STK17B的上游调节因子）在预测肝癌患者较差预后有很高的准确度。研究报道它可以调控胰岛素敏感性、糖耐量，并且在脂质蓄积的胰岛β细胞以及在HCC样本中高表达，根据越来越多的流行病学证据，NAFLD正迅速成为许多HCC病例病因的主要潜在因素，所以作者想要研究DRAK2在NAFLD的发展和进展中的作用。在本研究中，研究人员发现在肝脏细胞中，DRAK2通过与可变剪接因子SRSF6相互作用，促使线粒体功能相关基因的RNA可变剪接发生异常，从而干扰线粒体功能，推动NAFLD向NASH的发展。这一发现为NAFLD/NASH进展提供了一种新的机制，而靶向这一机制可能是NAFLD/NASH治疗的一种有前景的方法。

1. 在NAFLD/NASH患者和小鼠肝脏内，DRAK2的表达显著上升。

2. DRAK2通过SRPK1介导的SRSF6蛋白磷酸化来调节RNA可变剪接。

3. DRAK2通过RNA剪接机制干扰脂肪肝中的线粒体功能。

4. 抑制肝细胞DRAK2可以改善NAFLD/NASH发展。

研究结果

1.DRAK2表达在脂肪肝中显著上升，并与NAFLD/NASH的发展相关

      为了探究DRAK2在NAFLD/NASH发展过程中的作用，研究人员检测了NAFLD/NASH患者肝脏样本中DRAK2的表达，发现NAFLD/NASH患者肝脏中DRAK2蛋白水平显著升高，并且NAS（NAFLD 评分）分析结果表明肝脏DRAK2的表达和NAFLD的严重程度呈正相关（Figures 1A, 1B, S1A）。在HFD诱导和HFF（高脂高果糖饮食）诱导的NAFLD小鼠模型及db/db（瘦素受体缺失）小鼠的肝脏中，研究人员也发现DRAK2蛋白表达显著升高（Figure 1C，Figure S1B）。并且，研究人员利用PA（棕榈酸）处理小鼠原代肝脏细胞，发现DRAK2的表达呈PA浓度和处理时间依赖性升高（Figure 1D）。与DRAK2蛋白水平的变化一致，在脂肪肝、NASH小鼠模型以及PA处理的原代肝脏细胞中DRAK2 mRNA水平也都相应升高（Figure S1C）。

      为了进一步证实肝脏DRAK2表达和NAFLD进程的相关性，研究人员使用8型腺相关病毒（AAV-DRAK2）尾静脉注射小鼠来构建肝脏特异性过表达DRAK2小鼠（AAV-DRAK2小鼠）（Figure S1D），发现在HFD喂养下，与AAV-vector小鼠相比，AAV-DRAK2小鼠体重升高（Figure S1E），并且AAV-DRAK2小鼠的脂肪肝更为严重，具体表现为肝脏中脂质的积累，TG含量升高，以及脂肪酸β氧化基因表达下调，而肝脏中TC含量并没有明显差异（Figure 1E, 1F and 1G, Figure S1G）。CD68（M2型巨噬细胞的标志分子） IHC染色结果表明AAV-DRAK2小鼠肝脏炎症加重，且促炎基因表达水平升高（Figure 1H, Figure S1）。此外，AAV-DRAK2小鼠血清中与肝损伤相关的生物指标如ALT（丙氨酸转氨酶）、AST（天冬氨酸转氨酶）的水平也显著上升（Figure 1I）。TEM（透射电镜）分析发现HFD喂养的AAV-DRAK2小鼠线粒体嵴密度显著降低，并且线粒体功能相关基因的表达也显著下调，这表明线粒体结构被破坏（Figure 1J and S1I）。此外，以上结果均是在HFD条件下检测的，在NC（正常饮食）条件下并没有发生显著差异（Figure 1G,1I and S1E-S1I），这表明DRAK2在代谢压力下而非生理稳态下发挥重要功能。同时，研究人员使用AAV-shDRAK2构建了肝脏特异性敲减DRAK2小鼠（AAV-shDRAK2小鼠）（Figure S1J）。在HFD喂养16周后，研究人员发现，与AAV-scramble小鼠相比，AAV-shDRAK2小鼠的体重和肝脏重量均显著下降，脂肪肝得到改善，肝损伤也明显有所改善（Figure S1K, S1L, S1M and S1N）。此外，TEM分析显示，由HFD诱导的线粒体结构损伤在AAV-shDRAK2小鼠中也得到明显修复（Figure S1O）。

     总之，这些结果表明DRAK2的表达在NAFLD发展进程中显著上调。

Figure 1. DRAK2在脂肪肝中表达上调，并与NAFLD/NASH进展相关

Figure S1. DRAK2在脂肪肝中表达上调，并与NAFLD/NASH进展相关

2.肝脏特异性敲除DRAK2可改善由HFD诱导的脂肪肝以及由HFF诱导的NASH

      为了进一步证明肝细胞中DRAK2在NAFLD发病机制中所发挥的功能，研究人员构建了肝脏特异性敲除DRAK2基因小鼠（DRAK2-HKO小鼠）（Figure S2A）。在HFD喂养16周后，与DRAK2-Flox小鼠相比，DRAK2-HKO小鼠的体重降低（Figure S2B），脂肪肝现象也得到改善，具体表现为肝脏中较少的脂质积累以及TG含量的下降，而TC含量并没有发生显著差异（Figure S2C, S2D, S2E and S2F）。DRAK2-HKO小鼠的脂肪酸β-氧化基因表达水平也显著提高，但脂肪生成基因或者脂肪酸摄取基因（Cd36）没有差异（Figure S2G）。CD68 IHC结果表明DRAK2-HKO小鼠肝脏的炎症现象有所减轻，并且促炎相关基因表达显著下调，血清AST和ALT的水平也显著降低（Figure S2H, S2I and S2J）。TEM分析发现DRAK2-HKO小鼠肝脏线粒体嵴密度升高（Figure S2K），线粒体功能相关基因的表达也显著上调（Figure S2L）。这些结果表明肝脏特异性敲除DRAK2可以缓解由HFD诱导的肝脏脂肪变性、炎症以及线粒体受损现象。有趣的是，研究人员发现，qPCR结果显示DRAK2-HKO小鼠的肝细胞中mtDNA编码基因的mRNA水平变化程度较核DNA编码的线粒体功能相关基因的mRNA水平更为明显（Figure 2O）。

      这些结果证明了DRAK2可以加剧由HFD诱导NAFLD的发展，然而仅仅给小鼠饲喂HFD饮食并不能诱导肝损伤或肝纤维化，这限制了DRAK2在NASH模型中的功能研究。因此，为了在NASH小鼠模型中研究肝细胞中DRAK2的作用，研究人员给小鼠饲喂了HFF饮食（高脂高果糖饮食），发现与DRAK2-Flox小鼠相比，DRAK2-HKO小鼠体重和肝重都有所减轻，脂肪肝也得到改善（Figure 2A, 2B, 2C, 2D and 2E），同时，肝脏脂肪酸β氧化基因表达显著上调，而脂肪生成相关基因或脂肪酸摄取相关基因（Cd36）并没有显著差异（Figure 2F）。CD68 IHC结果表明肝脏的炎症现象也有所减轻，肝脏中促炎相关基因表达降低（Figure 2G and 2H）。Sirius Red染色结果发现DRAK2-HKO小鼠肝脏中胶原沉积以及羟脯氨酸水平（小编注：在肝脏胶原纤维合成时会产生羟脯氨酸，因此羟脯氨酸水平属于肝脏纤维化的标志物）显著下降，并且肝脏纤维发生相关基因表达显著下调（Figure 2I, 2J and 2K），这表明肝脏特异性敲除DRAK2基因改善了由HFF诱导的肝纤维化现象。TUNEL染色发现DRAK2-HKO小鼠肝细胞凋亡现象明显下降（Figure 2L）。同样的，在DRAK2-HKO小鼠血清中肝损伤相关生物指标AST和ALT水平降低，并且由HFF诱导的线粒体功能受损现象在DRAK2-HKO小鼠肝脏中有所减轻（Figure 2M, 2N and 2O）。同样研究人员在HFF喂养的DRAK2-HKO小鼠的肝细胞也发现了mtDNA编码基因的mRNA水平变化程度比核DNA编码线粒体功能相关基因的mRNA水平变化更明显，这说明在DRAK2促使肝细胞线粒体功能受损这一过程中，mtDNA的复制和转录起着重要作用。

      总之，这些结果表明，DRAK2表达上调可以促使脂肪肝向NASH发展，并且这一过程与肝细胞线粒体功能有密切关系。

拓展阅读

特立独行的线粒体

      线粒体是一个半自主细胞器，其自身含有遗传表达系统；但编码的遗传信息十分有限，其RNA转录、蛋白质翻译、自身构建和功能发挥等必须依赖核基因编码的遗传信息。线粒体由大约 500-1,400 种不同的蛋白质组成，核基因编码大多数线粒体蛋白质，而线粒体基因（mtDNA）主要编码rRNA、tRNA和部分线粒体蛋白质。由线粒体基因编码的线粒体蛋白大多是内膜的疏水蛋白，与许多核基因编码蛋白一起形成呼吸链。呼吸链包括5个组分，分别是NADH脱氢酶（也称为复合物I）、琥珀酸氧化酶（也称为复合物II）、细胞色素C还原酶（复合物III）、细胞色素C氧化酶（也称为复合物IV）和ATP合成酶（也称为复合物V）。

     本文中，NDUFV1和Cox7a属于核基因，NDUFV1主要编码复合物I的催化“核心”亚基，而复合物I中有5个亚基（ND1，ND2，ND3，ND5，ND6）是由mtDNA编码的；Cox7a主要编码复合物IV（细胞色素C还原酶）的亚基，发挥调控和稳定复合物IV的作用。而ND4和Cox2属于mtDNA，ND4主要编码复合体I亚基，Cox2编码线粒体复合体IV的亚基。另外，复合体III中的cytb亚基，ATP合成酶中的atp4亚基也是由mtDNA编码的。

Figure 2. 肝脏特异性敲除DRAK2可改善HFF诱导的NASH

Figure S2. 肝脏特异性敲除DRAK2可改善HFF诱导的NASH

3.DRAK2促进肝细胞脂质积累并损害线粒体功能

为了探究DRAK2促进肝细胞脂质积累的潜在机制，研究人员利用siDRAK2敲减肝细胞中的DRAK2基因，利用HA-DRAK2过表达肝细胞中的DRAK2基因（Figure S3A and S3B），随后用PAOA（软脂酸/油酸）处理原代肝脏细胞来促使肝细胞中脂质的积累（小编注：本文PA/OA处理来诱导肝细胞脂质积累的体外模型，其他体外实验则用PA处理来模拟HFD），发现与control相比，DRAK2的敲减减轻了细胞中脂质的积累，而DRAK2的过表达加剧了细胞中脂质的聚集（Figure 3A-3C, Figure S3C-S3F）。与在小鼠模型上得到的结果一致，在体外原代肝脏细胞培养中，研究人员发现BSA处理后siDRAK2细胞和NC细胞之间并无明显差异，而PA处理后，siDRAK2细胞中脂肪酸β氧化相关基因显著上调而脂肪生成相关基因表达无明显差异（Figure S3G）。此外，研究人员使用22b（DRAK2的特异性抑制剂）处理原代肝脏细胞后，发现靶向抑制DRAK2明显改善了PAOA诱导的脂质积累现象（Figure S3H）。随后研究人员利用[1-14C]棕榈酸（钠盐）和[1,2-14C]乙酸（钠盐）进行同位素示踪分析（小编注：利用[1-14C]棕榈酸通过β氧化整合进CO2的同位素的含量来判断脂肪酸β氧化的能力；[1,2-14C]乙酸可以生成C14同位素标记的乙酰辅酶A作为脂肪酸从头合成的底物，将生成的脂肪酸带上同位素标记，从而判断脂肪酸从头合成的能力）,发现与NC细胞相比，敲减DRAK2基因后促进了原代肝脏细胞的脂肪酸β氧化途径，过表达DRAK2基因则进一步抑制了脂肪酸β氧化，而脂肪生成途径并无显著差异（Figure 3D and 3E）。这表明DRAK2在线粒体响应的代谢应激中发挥负调作用。 

      接下来，为了探究DRAK2对线粒体功能有何影响，研究人员利用TEM分析线粒体结构，发现PA诱导，下原代肝脏细胞中线粒体结构明显受损，而敲减DRAK2后线粒体结构受损现象有所修复（Figure 3F）。此外，OCR结果表明在敲减DRAK2后线粒体功能相比于NC细胞有所提高，且22b处理也明显提高了原代肝脏细胞的线粒体功能（Figure 3G and 3H, Figure S3I）。同时，敲减DRAK2基因后，原代肝脏细胞中由核DNA或mtDNA编码的线粒体功能相关基因表达上调（Figure 3I），并且在siDRAK2原代肝脏细胞和HFF喂养的DRAK2-HKO小鼠肝脏中，均发现mtDNA的拷贝数升高（Figure 3J and 3K），这进一步表明了DRAK2抑制mtDNA复制。

       总之，这些结果表明DRAK2通过损害肝细胞线粒体功能来促使NAFLD的发展。

Figure 3. DRAK2促进肝细胞脂质积累并损害线粒体功能

Figure S3. DRAK2促进肝细胞脂质积累并损害线粒体功能

 4.DRAK2通过抑制SRPK1-SRSF6信号通路来调控RNA的可变剪接

DRAK2是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因此接下来研究人员想要研究DRAK2是如何调控线粒体的功能，尤其是整体磷酸化水平这一方面。通过质谱对BSA/PA处理的DRAK2-Flox和DRAK2-HKO小鼠原代肝脏细胞进行磷酸化修饰定量分析（Figures 4A and S4A），鉴定出5237个磷酸化蛋白（定位概率>0.75）（小编注：在磷酸化蛋白组学的数据分析中，在对数据进行归一化的之后，筛选蛋白翻译后修饰位点覆盖率> 0.75用于进一步分析），其中在敲除DRAK2基因的原代肝脏细胞中，BSA处理下有84个蛋白磷酸化修饰在DRAK2敲除后发生显著变化，且这些磷酸化蛋白主要富集在与RNA剪接相关的通路上（Figure S4B and S4C），而PA处理后有175个蛋白磷酸化发生显著改变，大约9%（12/130）磷酸化蛋白与RNA剪接有关，包括SRSF剪接因子和SRRM基质蛋白（Figure 4B）。GO分析也表明这些磷酸化蛋白主要参与了RNA剪接和其他mRNA相关通路（Figure 4C）。接下来，为了进一步研究DRAK2对线粒体功能的调控机制，研究人员通过IP-MS（免疫沉淀和质谱分析）来鉴定与DRAK2相互作用的蛋白，获得了109个候选蛋白，经蛋白互作网络分析发现这些蛋白也富集在RNA剪接途径中（Figure 4D,4E）。更重要的是，研究人员发现一些SRSF剪接因子也包含在其中，包括SRSF6，SRSF10，SRSF1，SRSF9和SRSF3。

      研究人员通过coIP实验进一步发现DRAK2与SRSF6直接结合（Figure 4F）。由于DRAK2是一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，因此研究人员推测DRAK2可能通过调控SRSF剪接因子的蛋白磷酸化水平来调控RNA的可变剪接。于是，研究人员检测了DRAK2是否可以调控SRSF6的磷酸化水平，发现在HFD喂养的DRAK2-HKO小鼠肝脏中SRSF6的磷酸化修饰水平升高（Figure 4G）。接下来研究人员利用MS分析DRAK2是否直接调控SRSF6的磷酸化修饰水平，然而并没有观察到依赖于DRAK2催化的磷酸化反应（数据未展示），这表明DRAK2间接调控SRSF6的磷酸化修饰。于是，研究人员推测，可能是DRAK2与SRSF6结合，通过抑制SRSF6上游激酶如SRPK1的功能而下调SRSF6的磷酸化修饰。经coIP实验验证发现SRSF6与SRPK1相互作用，且过表达DRAK2后，DRAK2与SRSF6结合，从而抑制了SRPK1与SRSF6的相互结合（Figure 4H, 4I and 4J）。有文献表明，大多数SR蛋白在发生高度磷酸化后，会从细胞质转移到细胞核中，参与RNA可变剪接过程。研究人员经IF（免疫荧光）分析发现在DRAK2-HKO小鼠原代肝脏细胞中无论PA还是BSA处理均会促使SRSF6会发生核转位，然而在DRAK2-Flox小鼠原代肝脏细胞中，PA处理则会抑制SRSF6的核转位（Figure S4D），随后研究人员分离原代肝细胞的细胞核和细胞质并分别进行了WB实验，发现在敲减DRAK2条件下，BSA或PA处理SRSF6都会发生核转位，同时还发现在NC状态下，与BSA处理的原代肝脏细胞相比，PA处理会抑制SRSF6的核转位（Figure 4K）。

      以往研究表明，SRSF6一旦与SRPK1结合，SRSF6便会发生高度磷酸化修饰，并从细胞质转位于细胞核中，调控RNA的可变剪接。而本文的结果发现，在代谢应激刺激下肝细胞中DRAK2表达升高，DRAK2与SRSF6结合抑制了SRSF6的磷酸化修饰，导致SRSF6不能转位到细胞核中发挥正常的mRNA剪切功能。相反，当肝细胞中缺失DRAK2，可以促使SRSF6与SRPK1相互作用，提高SRSF6的磷酸化修饰水平。DRAK2-SRSF6轴便是通过这种机制参与了RNA的可变剪接过程。

Figure 4. 结合磷酸化蛋白组学和蛋白互作组学分析揭示DRAK2网络

FigureS4. DRAK2调控的底物以及互作蛋白的磷酸化定量蛋白组学分析

由于DRAK2首次被证明可以调节RNA的可变剪接，接下来研究人员深入探究了在NAFLD发展中的DRAK2靶向RNA可变剪接的作用机制。为此，研究人员从HFF或NC喂养的DRAK2-Flox和DRAk2-HKO小鼠肝脏中提取出总RNA并进行RNA-seq，得到了所有RNA可变剪接的结果（Figure 5A and 5B, Figure S5A and S5B），发现在NC喂养下，DRAK2-Flox小鼠与DRAK2-HKO小鼠之间有233个基因的RNA可变剪接形式不同，而在HFF喂养下，DRAK2-Flox小鼠与DRAK2-HKO小鼠之间有692个基因的RNA可变剪接形式不同。有趣的是，无论是NC喂养还是HFF喂养条件下，在RNA可变剪接形式发生异常的基因中，20%以上都发生在线粒体功能相关基因上，这表明DRAK2参与调控了线粒体功能相关基因的RNA可变剪接模式（Figure 5C, 5D, S5C and S5D）。接下来研究人员验证了线粒体功能相关基因的RNA可变剪接，如Polg2、Nudt13、Guf1、Rnase1和Nme4，发现这些基因的RNA可变剪接模式在NASH小鼠肝脏中发生异常，而这些变化在DRAK2-HKO小鼠中则基本恢复正常（Figures 5E and 5F）。这些结果表明DRAK2促使NAFLD发展进程中线粒体功能相关基因的RNA可变剪接模式发生异常。 

研究人员首次发现了SRSF6是DRAK2的一种新的互作蛋白，为了进一步验证在NAFLD发展过程中DRAK2是否通过SRSF6来调控线粒体功能相关基因的RNA可变剪接，研究人员使用了SRSF6 siRNA来敲减DRAK2-Flox小鼠和DRAK2-HKO小鼠原代肝细胞中的SRSF6基因，发现由PA诱导的线粒体功能基因（如Polg2、Nudt13、Guf1、Rnasel和Nme4）RNA可变剪接发生异常的现象，在DRAK2-HKO小鼠原代肝脏细胞中基本恢复正常，而在敲减SRSF6的DRAK2-HKO小鼠原代肝脏细胞中这种恢复现象明显减弱（Figure 6A），并且，由PAOA诱导的肝细胞脂质积累现象在DRAK2-HKO小鼠原代肝脏细胞中得到显著改善，而在敲减SRSF6的DRAK2-HKO小鼠原代肝脏细胞中这种改善作用消失（Figures 6B, S6A, and S6B）。此外，OCR实验结果显示，由PA诱导的原代肝脏细胞线粒体功能紊乱现象，在DRAK2-HKO小鼠原代肝脏细胞中也有所改善，而敲减SRSF6后则抑制了DRAK2-HKO小鼠原代肝脏细胞中这一改善作用（Figure 6C）。

另外，研究人员利用AAV-shSRSF6构建了肝脏特异性敲减SRSF6小鼠（AAV-SRSF6小鼠）（Figure S6C），GAN饮食（高脂高胆固醇高果糖饮食，含有40%脂肪、22%果糖和2%胆固醇，用来构建NASH模型）喂养14周，结果发现GAN诱导线粒体相关基因（Polg2、Nudt13、Guf1、Rnase1和Nme4）的RNA可变剪接模式发生紊乱，而这一现象在AAV-shSRSF6小鼠肝脏中被进一步加剧（Figure 6D），并且伴有更加严重的肝脏脂肪变性，具体表现为肝脏中脂质的积累以及TG含量的升高，这与AAV-DRAK2小鼠的表型非常相似（Figure S6D, S6E, S6F and S6G）。与NC喂养小鼠相比，GAN喂养的小鼠血清中肝损伤生物指标如AST和ALT水平并没有发生显著差异，这或许是因为喂养14周GAN饮食不足以引起小鼠的肝损伤，然而GAN喂养的AAV-shSRSF6小鼠发生了明显的肝损伤现象（Figure S6H），表明肝细胞中SRSF6的缺失可以加剧NAFLD的发展。总之，这些数据进一步验证了DRAK2与SRSF6之间的相互作用，表明了DRAK2通过SRSF6来调控肝细胞线粒体功能相关基因的RNA可变剪接，进而调控NAFLD向NASH的发展。

在已验证的DRAK2调控线粒体功能相关基因的RNA可变剪接中，Polg2负责编码DNA聚合酶亚基γ-2，该DNA聚合酶负责催化mtDNA的复制，并在线粒体功能中起着关键作用。在PA处理的原代肝细胞以及HFF诱导的小鼠肝脏中， Polg2基因的RNA可变剪接异常，其 mRNA水平显著升高，且mRNA序列上保留了外显子2（Polg2-exon2+）（小编注：一般Polg2的转录本不包含exon2）。接下来，为了研究Polg2与Polg2-exon2+编码序列所发挥的功能有何不同，研究人员针对这两个编码序列构建了Polg2质粒和Polg2-exon2+质粒，并分别转染原代肝脏细胞，发现Polg2-exon2+促使mtDNA复制过程和线粒体功能发生紊乱（Figure 6E, 6F and 6G）。这个结果也解释了之前的一个研究结果，即在NAFLD发展进程中DRAK2的高表达促使mtDNA复制和线粒体功能发生异常。 

总之，这些结果表明DRAK2-SRSF6轴通过促使线粒体功能相关基因的RNA可变剪接发生异常，从而加剧NAFLD向NASH的发展。

Figure 5. DRAK2调控HFF诱导的NASH小鼠肝脏线粒体功能相关基因的RNA可变剪接

Figure S5. HFF喂养的DRAK2-HKO小鼠整体RNA剪接分析 

Figure S6. DRAK2-SRSF6轴调控PAOA诱导的肝细胞脂质积聚现象和GAN饮食诱导的肝脏脂肪变性

6.DRAK2-SRSF6的药物干预可以改善HFD诱导的肝脂肪变性和HFMCD诱导的NASH

    接下来，研究人员在HFD小鼠模型上研究了靶向干预DRAK2-SRSF6轴是否可以有效缓解NAFLD的发展，发现与HFD小鼠相比，22b处理的小鼠（HFD-22b小鼠）肝脏中脂质积累明显减少，TG水平显著下降，且HFD-22b小鼠血清中AST和ALT水平也明显降低（Figures 7A, 7B and 7C）。DRAK2蛋白表达水平降低，SRSF6的磷酸化水平（SRp55）显著升高（Figures 7D）。由HFD诱导的线粒体功能紊乱在HFD-22b小鼠肝脏中也显著得到改善（Figures 7E）。最重要的是，随着SRSF6蛋白的高度磷酸化修饰，由HFD诱导的线粒体功能相关基因（如Polg2，Nudt13，Guf1，Rnasel以及Nme4）的RNA可变剪接异常现象在HFD-22b小鼠肝脏中也显著降低（Figures 7F and 7G）。

      接下来，为了研究靶向干预DRAK2-SRSF6对NASH的影响，研究人员给小鼠喂养HFMCD（缺乏甲硫氨酸和胆碱的高脂饮食）饮食，发现给HFMCD喂养的小鼠腹腔注射22b并不影响小鼠的体重和进食量，但肝脏重量显著降低，肝脏脂质积累也明显下降，TG水平降低。同时，血清中AST和ALT的水平也明显下降（Figure S7A, S7B, S7C, 7H, 7I and 7J）。而且，Sirius Red染色结果表明22b处理改善了小鼠的肝纤维化现象（Figure S7D）。此外，研究人员对NC喂养的小鼠进行腹腔注射22b，并没有发现明显的差异现象，这进一步证明了DRAK2的作用是响应肝细胞的代谢应激，而不是生理稳态。

Figure 7. 22b的药物干预可改善HFMCD诱导的肝脏脂肪变性和NASH

Figure S7. 22b的药物干预可改善HFMCD诱导的NASH

总结

       本篇文章首次发现了DRAK2通过与RNA剪接因子SRSF6结合，导致线粒体功能相关基因（包括mtDNA聚合酶POLγ2）的RNA可变剪接异常，并通过体内体外实验充分论证了线粒体功能相关基因的RNA可变剪接异常是NAFLD/NASH发展的关键病理分子机制。在该研究中，研究人员首先在NAFLD/NASH患者以及小鼠模型的肝脏样本中发现DRAK2的表达升高，且与NAS评分呈正相关关系。为了探究其机制，研究人员利用AAV8-shDRAK2/DRAK2构建了肝脏特异性敲减/过表达DRAK2小鼠模型，以及用Loxp-Cre系统构建肝脏特异性敲除DRAK2小鼠模型，揭示了DRAK2高表达通过促使线粒体功能紊乱来推动NAFLD/NASH的发展。随后研究人员基于磷酸化修饰组学、蛋白互作质谱组学以及转录组学等多维度分析，阐明DRAK2通过与RNA剪接因子SRSF6结合促使线粒体功能相关基因的RNA可变剪接发生异常，从而抑制线粒体生物合成与功能、促进NAFLD/NASH病理进程。最后，研究人员利用DRAK2抑制剂22b探究其对NAFLD/NASH的药理性干预作用，进一步论证了在NAFLD/NASH病理进程中DRAK2-SRSF6这一全新分子机制，并提示其作为新靶向策略干预非酒精性脂肪肝炎的可行性。

       总之，该项研究首次发现NAFLD/NASH病理进程中肝脏线粒体功能相关基因的RNA选择性剪接失调，为治疗NASH的药物研发提供新的靶标以及可能的干预手段，具有重要的转化价值与临床意义。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1550413121004277