Step1：麻醉小鼠（小鼠年龄最好年轻一些），喷酒精，擦干后固定小鼠

（无菌最重要啦~）

Step2：打开小鼠腹腔，找到肝门静脉和下腔静脉

Tips：开腹过程一定要注意防止鼠毛进入腹腔。小编贴心提示可以将身体两侧皮肤用针头翻到侧旁后，用针头固定，可使腹腔尽可能暴露，便于寻找血管和观察肝脏灌流、消化情况。

Step3：肝门静脉插入留置针，蠕动泵调至 30（流速约为 5ml 每分钟），使用蠕动泵进行灌流液（Buffer Ⅰ）灌流，并打开下腔静脉，直到肝脏没有血冲出

（手要稳稳的哦~）

Step4：换胶原酶Ⅳ继续进行灌流消化，至肝脏柔软

Tips：消化到恰到好处至关重要。为了保证消化到位，在消化液灌入肝脏消化开始后，用无菌棉签或静脉夹夹闭下腔静脉，夹闭位置位于下腔静脉开口上方，靠近开口处。使得肝脏膨大，然后放开，如此反复数次。直至观察到肝脏表面呈现蜂窝状，用镊子轻触肝脏，会留下小洞，此时消化刚刚好。若消化不到位，则提取不到足量的细胞，且过滤网时需要用较大的力度去辅助研磨，易造成肝细胞的机械损伤，导致提取失败。若消化过度则会引起肝细胞死亡，导致活细胞得率大幅度降低。

Step5：下肝到有 10ml Buffer Ⅱ的10cm dish 中，修去非目的组织；过筛：100um 筛网过滤消化好的肝脏组织，用 DMEM 培养基辅助冲洗

Tips：在剪下肝脏那个的过程中要注意保证肝脏的完整性，不要有破损。过筛的时候用5mL注射器的胶塞轻轻研磨，辅助过滤。研磨不能过于用力，会造成肝细胞的机械损伤。消化好的肝脏在轻轻触碰后肝膜即破裂，肝细胞会自然进入DMEM中，顺着液体过筛后进入下方离心管中。

Step6：50g 离心 2min，弃上清，再加入DMEM 培养基重悬（重复四次）

Tips：重悬的时候一定要注意用移液器轻轻吹打，吹打动作要轻柔。刚刚经过胶原酶消化的肝细胞极其脆弱，过于用力会导致肝细胞破碎，提取失败。

Step7：最后一次弃上清，然后加入 10% FBS DMEM 培养基重悬，细胞计数，铺板

Tips：成功的提取，活细胞数量一般在80%-90%之间。铺板密度要合适，一般采用6孔板 1X10⁵~10⁶/孔。由于肝细胞沉降较快，因此在铺完一块板后记得轻轻吹打剩余的含细胞培养基，重悬均匀后再继续铺板。

Step8：6 小时后换液，之后每天换液。一般情况下，首次换液 48 小时后可以进行实验。