2.      材料与方法

2.1.　动物

雌性NMRI小鼠（远交种），四周龄，购买于Charles River 实验室（Sulzfeld, 德国）

2.2.　标准品疫苗和待检疫苗

“第五批狂犬病疫苗WHO国际标准”，16 IU/瓶，购买于英国国家生物制品检定所（NIBSC, Hertfordshire，英国）。第四批生物参考制品（BRS），效价为11 IU/瓶，由欧洲药品质量管理局提供（EDQM, Strasbourg，法国）。标准品保存于-20℃，接种时重新溶解于1ml注射用水中。本文中提及的所有标准稀释液都出自标准储存液。待检疫苗，我们使用各种不同疫苗株的商品化灭活疫苗（SAD株、Flury LEP株、Pasteur株）。本研究共涉及来自6个不同生产商的14种液体佐剂狂犬病疫苗。

免疫过程中，标准参考疫苗和待检疫苗均用PBS缓冲液稀释。

2. 3.　攻击病毒

狂犬病标准攻击毒株CVS-27(ATCC VR-321)，是实验室固定毒株，获自Behringwerke(Marburg, 德国)。病毒在鼠脑繁殖后，CVS悬液保存于-80℃小毒种管中。CVS病毒稀释液是含有2%马血清的蒸馏水。

2.4.　标准血清

“第二批人源抗狂犬病免疫球蛋白（RAI）WHO国际标准”，获自NIBSC。阴性对照血清采自未免疫小鼠。

2.5.　小鼠攻毒试验检测狂犬病疫苗效价

该实验按欧洲药典规范进行，执行实验室内部SOP。简言之，标准参考疫苗和待检疫苗在计划的试验中按照指定浓度稀释。如果没有其它特别说明，每种疫苗有四个系列稀释度。第0天，每个稀释度0.5 ml 腹腔注射免疫小鼠。第14天，麻醉小鼠，脑内注射30μl CVS悬液、大约50 LD50剂量的病毒。对照组，未免疫小鼠脑内注射30μl CVS 悬液或者10^-1—10^-3稀释度的病毒。记录在攻毒后的第5天至第14天中死于狂犬病的小鼠的数量。给具备明显狂犬病症状的实验动物实施安乐死，避免不必要的痛苦。只有当该检测符合欧洲药典规定的所有效力标准时，这种检测才能被认为是有效的。通过使用CombiStats软件 (EDQM)概率分析，计算待检疫苗的相对效价。依据欧洲药典标准，除疫苗生产商规定的某些特殊疫苗效价高于2 IU/ml 以外 ，其它检测疫苗效价高于1 IU/ml 即被认为通过攻毒实验。

2.6.　血清学试验检测狂犬病疫苗效价

   　该检测必需符合欧洲药典相关规定，细微修改依据实验室内部SOP.给实验动物免疫1/5剂量的待检疫苗或者是调整到最低效价（1IU/ml）的标准参考疫苗。免疫程序如下：腹腔免疫，每组6—30只小鼠，每支小鼠免疫剂量0.2 ml或者是文中规定的稀释标准。在某些检测个案中，免疫途径也可以是肌肉或者皮下注射。免疫后的第14天，通过心脏穿刺或者从眼眶采血。通过RFFIT检测血清中抗狂犬病毒中和抗体。

2.7.　快速荧光灶抑制试验（RFFIT）

   　该检测遵从欧洲药典中相关规定。简言之，1:100稀释的检测血清和2 IU/ml抗狂犬病毒免疫球蛋白（RIA）标准血清进行3次倍比稀释。每个稀释度100μl加入细胞培养板中，再加入100μl CVS 悬液。该悬液中含有100 CCID50细胞培养感染剂量的病毒。37℃孵育90 min后,每孔加入200μl BHK-21细胞悬液（5×10⁵/ml）。每次试验要作病毒滴度对照和不作任何处理的细胞对照。37℃孵育24h后，PBS洗涤细胞，80%丙酮固定细胞，用荧光素标记的抗狂犬病毒抗体（Microtest, 德国）37℃孵育30 min。2次PBS和1次水洗涤后，分析至少含有一个荧光细胞的视野的数量。当某一稀释度引起视野中感染细胞减少50%时，通过使用CombiStats软件计算待检血清抗体效价。国际标准品的检测结果是以效价倒数的形式显示的。只有当CVS滴度在30-300 CCID50之间，而且统计学分析显示有意义的斜率，不背离线性和平行性时，该检测结果才被认为是有效的。

2.8.　改良的RFFIT

该检测除了使用微量滴定板替代细胞培养板之外，基本按照欧洲药典标准执行。1：10稀释的检测血清和RAI标准血清（校正到2 IU/ML）进行3次对倍稀释。每个稀释度50μl加入到微量滴定板中，再加入50μl CVS悬液。该悬液中含有100　CCID50剂量的病毒。在每次试验中需作10倍稀释度的病毒对照以及不做任何处理的细胞对照。37℃孵育1h，每孔加入100μl BHK-21细胞悬液（2.5×10⁵/ml）。37℃孵育48h后，洗涤、固定、染色步骤如前文所述。最后，分析每孔中荧光细胞的数量，使用CombiStats软件计算检测血清抗体效价。只有当RFFIT满足前文提到的检测标准时，该检测结果才能够被认为是有效的。国际标准品的检测结果是以效价倒数的形式显示的。相反，待检疫苗的检测结果是以免疫试验动物（每组6只）百分数的形式显示的。该检测结果中抗狂犬病毒中和抗体效价比用第四批BRP标准参考疫苗（1 IU/ml）免疫的对照组平均效价高。依据我们的内控指标，只有当至少5/6待检疫苗免疫组的小鼠（即83%的动物）抗狂犬病毒中和抗体效价高于对照组小鼠，该检测疫苗的效价才被认为是合格的。

2.9.　 对比研究两种效价检测方法的实验设计

   为了比较两种效价检测方法，采用两种不同的技术路线进行对照研究：在一些个案中，两组不同的实验小鼠分别采用小鼠攻毒试验和血清学检测方法测定效价。这些个案中，通过心脏穿刺实验动物的方法来采集用于效价检测的血液。然而在其它个案中，每组试验小鼠采用两种检测方法。这些个案中，免疫后的第14天，所有试验小鼠通过从眼眶采血的方法来采集血液，然后，这些动物都用CVS进行攻毒。

2.10.　统计学分析

小鼠攻毒试验和血清学检测结果之间的相关性通过Pearson相关系数检验。在前文2.9中提及的两种方式的小鼠存活率之间仅有很小的差异（数据没有列出），所有的结果通过归类汇总来计算相关系数。

采用多因素混合模型，将自变量数据（因变量为效价的对数）同固定因素，如接种途径、疫苗以及稀释度等一起做回归，分析这两种技术路线之间的差异。为了减小任何潜在的检测变异导致的系统误差，检测日期也作为随机因素纳入。95%可信区间和P值都依据bonferroni方法进行调整，目的是在多因素对照分析中控制系统误差率。通过SAS/STAT软件，9.1.3版本，Windows操作系统，进行统计分析。

通过Lin’s回归分析，比较RFFIT与改良RFFIT之间的相关性。

[ Biologicals, 2009, 37: 119-126, 唐　芳译，严家新校 ]

[译文载武汉生物制品研究所内部刊物《疫苗与免疫》2009,4(2)：40-42]