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3. 结果
3.1. 免疫反应的测定
为了了解该免疫反应的特性,将“第五批狂犬病疫苗WHO国际标准品”, 按照1:4、1:16、1:80、1:400稀释,免疫小鼠,每组10只。免疫后第11天、14天、17天、21天采集血液,用RFFIT检测抗狂犬病毒中和抗体。大部分结果显示,在狂犬病毒中和抗体的效价在免疫后的第14天达到最大值(表1)。所有数据表明,1:4稀释的标准疫苗,产生的抗狂犬病中和抗体效价最高。相反,1:400稀释的标准疫苗,产生的抗狂犬病中和抗体效价最低。
3.2. 比较标准疫苗在小鼠攻毒试验和血清学检测中的结果
为了比较两种效价检测方法的结果,用小鼠攻毒试验和血清学试验,平行地检测不同稀释度的WHO第5批和BRP第4批标准品。该实验结果来自8个独立子试验共1032只小鼠。图1A显示的为WHO第5批标准品的试验结果,图1B显示的为BRP第批标准品的试验结果。
图1B小鼠攻毒试验检测方法中,小鼠存活率的曲线表现出很大的波动。相反地,表1A和表1B中抗狂犬病毒抗体效价平均值则表现出很好的量-效关系。
然而,组内免疫相同稀释度疫苗的小鼠抗狂犬病毒中和抗体效价则表现出很大的波动(数据没有显示)。甚至出现无法检测到抗狂犬病毒中和抗体的动物。
为了测定两种检测方法之间的相关性,用血清学检测WHO第5批和BRP第4批标准品免疫后中和抗体平均效价与小鼠攻毒试验中小鼠存活率之间有曲线关系(图2)。Pearson积差相关系数0.82,提示两种检测系统的结果之间具有很好的相关性。
3.3. 比较不同待检疫苗在小鼠攻毒试验和血清学检测中的结果
来自6个不同的生产商的14种兽用狂犬病疫苗在两个检测系统中平行检测。图3显示在小鼠攻毒试验中检测阴性的疫苗在血清学检测中同样不能达到检测标准。同理,在小鼠攻毒试验中检测阳性的疫苗也能在血清学检测中达到的标准。两种检测方法的结果(尽管在本研究中涉及到不同的疫苗)相关系数为0.83。
3.4. 接种途径对抗体效价的影响
使用包括WHO第5批和BRP第4批标准品在内的6种不同的狂犬病疫苗检测不同的免疫途径对狂犬病毒中和抗体效价的影响。每种疫苗平行地注射2组小鼠:第1组小鼠腹腔注射,第2组小鼠肌肉或者皮下注射。免疫后第14天,RFFIT检测每组小鼠的平均中和抗体效价(图4)。数据显示,尽管组内小鼠中和抗体效价差异很大(数据未显示),不同免疫途径小鼠中和抗体平均效价差异显著。皮下注射组小鼠产生的中和抗体效价最低(P<0.0001 同腹腔注射组相比)。肌肉注射不同疫苗后检测中和抗体效价,明显高于皮下注射组(P<0.0001),但是仍然低于腹腔注射组(P=0.0309).图4中所有的标记符号都明显的位于二分线以下。
3.5. RFFIT的改良
为了使大样本检测更加简便、高效,我们用微量滴定板替代细胞培养板以及调整样品和缓冲液的用量,从而改良RFFIT。而且,我们以往的试验数据(数据未显示)表明长时间的孵育有助于实验结果的一致性,因此加入细胞后的孵育时间由24h延长到48h。图5显示欧洲药典中改良RFFIT和标准RFFIT方法检测结果的对照研究。分析这两种方法结果的相关性,相关系数0.988。
[ Biologicals, 2009, 37: 119-126, 唐 芳译,严家新校 ]
[译文载武汉生物制品研究所内部刊物《疫苗与免疫》2009,4(2):40-42]
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