狂犬病的实验室诊断(13)

前记:   目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章 狂犬病的实验室诊断(13)

(Laboratory diagnosis of rabies)​

4 病毒RNA检测的分子生物学方法(续)

(Molecular methods of viral RNA detection)

4.2 RNA提取

(RNA extraction)

在将分子生物学方法应用于样本之前，必须首先从待测组织中回收总RNA或总核酸。一种常用的方法使用名为TRIzol的商业试剂，这是一种基于早期酸性酚RNA提取方法的酚/异硫氰酸胍溶液。该试剂能迅速灭活任何存在的核酸酶，并快速溶解脑组织等软组织，因此特别适用于狂犬病诊断。向混合物中加入氯仿以促进液相分离后，水相中回收的RNA很容易通过加入异丙醇沉淀。该方法相当简单，并且就样本数量而言，适用于中等通量。

有时使用的其他方法依赖于市售试剂盒，这些试剂盒避免使用有毒化学品和RNA沉淀步骤；例如，提供硅膜离心柱方法从各种组织类型中回收总RNA的试剂盒。近年来，磁珠技术在核酸纯化中的应用促成了使用96孔板形式的平台开发，从而实现高通量样本处理。有几家公司销售采用这种技术的仪器。该技术依赖于核酸与磁珠颗粒的结合，然后经过多次洗涤步骤去除其他污染物，最后从颗粒上洗脱高度纯化的核酸。

4.3 逆转录-聚合酶链反应方法（RT-PCR）

(Reverse transcription-polymerase chain reaction methods)

自PCR技术出现以来（Saiki & Erlich, 1989），许多研究描述了其在为多种病原体开发高灵敏度诊断方法中的应用。检测狂犬病病毒和其他狂犬病病毒属病毒的试验涉及RT-PCR，其中使用逆转录酶将病毒RNA靶标转化为cDNA拷贝，然后扩增由一对合成寡核苷酸或引物定义的靶标序列（World Health Organization, 2018a）。该方法通常用于对疑似患病动物或人类的新鲜尸检脑组织进行检测。该技术也可应用于唾液、皮肤样本（通常从疑似患病的人类生前采集）、唾液腺，实际上几乎可以应用于任何其他组织或样本，例如生前采集的尿液，但在解释检测结果时需适当考虑此类样本中存在病毒的可能性。与DFA试验相比，RT-PCR的处理时间可能较长且相对昂贵，具体取决于所用检测方法的细节，并且该技术的高敏感性可能因样本交叉污染风险增加（从而导致假阳性结果）而带来不利影响。尽管有这些考虑，该技术在狂犬病病毒诊断中的应用正日益增加。

PCR的原理依赖于使用两种合成的寡核苷酸，它们能够与双链DNA靶标的两条链杂交，并且其方向使得当它们启动新的DNA合成时，新合成的DNA链在序列上重叠。该反应由热稳定性DNA聚合酶催化，需要重复的热循环：首先，高温（95°C）使DNA模板变性为单链；然后较低温度（通常45-60°C）使寡核苷酸与其靶序列退火；最后孵育（通常72°C）使退火的寡核苷酸使用所有四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）的混合物作为底物，启动DNA合成。此循环重复25-40个循环，成功的PCR会产生特定长度的双链DNA产物（扩增子），其两端由反应中使用的引物界定。靶序列的扩增程度（通常超过100,000倍）是该检测方法具有高灵敏度的基础。

检测方法设计的关键是仔细考虑要靶向的病毒组，这将取决于在特定地理区域可能遇到的病毒的性质。例如，在美洲，能够成功扩增所有已知狂犬病病毒的引物在大多数情况下范围足够广泛，因为任何本地获得性狂犬病病毒感染都是由经典狂犬病病毒引起的。在其他地区，特别是非洲和欧洲，存在更多差异较大的狂犬病病毒，因此需要能够检测多种狂犬病病毒物种的检测方法。在所有这些情况下，需要关于病毒基因组靶向区域核苷酸序列多样性的全面信息，以帮助设计能够支持开发具有所需特异性和包容性的检测方法的引物。

自首次描述PCR作为狂犬病病毒检测工具以来，该技术已经发展，用于检测扩增产物的方法也有了显著改进。传统方法使用琼脂糖凝胶电泳来确定是否存在预期大小的产物，但这进一步延长了检测的报告时间，并因额外处理通常高浓度的产物而增加了样本交叉污染的可能性。当应用巢式PCR（对第一轮PCR产物进行第二轮扩增以最大化检测灵敏度）时，这尤其成问题。通过使用各种荧光方法实时检测扩增子产生的方法的出现，消除了通过凝胶电泳进行产物分析的需要，从而既简化了方法，又减少了假阳性结果的可能性，因为不再需要对反应进行PCR后处理。这些检测方法还将灵敏度提高到与巢式PCR方法相当或更高的水平。表12.2列出了一些多年来文献中描述的比较常用的RT-PCR检测方法，其中许多检测方法的主要特点将在以下章节中进一步详述。

（未完待续）

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