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狂犬病的实验室诊断(12)

已有 179 次阅读 2026-5-17 02:54 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦

狂犬病的实验室诊断(12)

前记:

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第12章是《Laboratory diagnosis of rabies(狂犬病的实验室诊断）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第12章狂犬病的实验室诊断(12)

(Laboratory diagnosis of rabies)

4 病毒RNA检测的分子学方法

(Molecular methods of viral RNA detection)

4.1 分子学方法的优缺点

(Advantages and disadvantages of molecular methods)

在大多数情况下，分子学方法使用称为逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的扩增策略来检测病毒RNA，这与DFA检测中检测病毒蛋白的传统方法不同。由于两类检测中靶标分子性质的差异，需要考虑其性能上的差异。

由于遗传密码的冗余性，核酸基因组水平的变异显著大于蛋白质水平的变异(Bourhy, Kissi, & Tordo, 1993; Kuzmin, Hughes, Botvinkin, Orciari, & Rupprecht, 2005)。因此，使用分子学方法可能更容易出现未能检测到样本中存在的病毒（假阴性结果），因为分子学方法通常依赖于相对较短的核酸片段（寡核苷酸）与基因组靶标上至少两个不同位置的杂交，而DFA检测方法则基于抗体-抗原结合策略。由于抗体检测的表位比特定核苷酸序列更可能具有保守性，当需要一种能够检测多种丽沙病毒的广谱反应性检测时，血清学方法具有优势。此外，基于分子学的方法通常比DFA检测更耗时且成本更高。然而，丽沙病毒基因组序列中存在保守区域；因此，泛丽沙病毒分子学检测不仅可行，而且已有多个实例。有利的一面是，基于扩增过程的分子学方法具有高度的敏感性。但是，如果在组织处理或扩增过程本身未能严格注意此类检测的操作要求，这种高敏感性可能会因样本交叉污染而加剧假阳性结果的可能性(Kwok & Higuchi, 1989)。因此，对于在疾病终末期采集的、脑中病毒抗原水平较高的新鲜脑组织的常规狂犬病诊断，仍然使用DFA检测进行；由于DFA检测的快速性和成本效益，它仍然是狂犬病死后诊断的金标准(OIE, 2018b; World Health Organization, 2018a)。然而，在某些情况下，DFA检测的性能并非最佳，此时如果谨慎正确地应用分子学方法，则可以提供确认性或替代性的诊断能力。此外，当该程序产生阳性扩增结果时，对产物的序列特征进行鉴定并与其他参考病毒进行比较，可以阐明其变异类型、最常见传播的物种以及密切相关的病毒在地理上的流行区域。

各种核酸扩增检测的效用和应用已有综述(Wacharapluesadee & Hemachudha, 2010)，本文对此信息进行了更新。

当应用于严重腐烂的脑组织时，DFA检测程序的敏感性迅速下降。对照观察表明，在这种情况下，像RT-PCR这样的分子学检测方法可能具有更高的敏感性(David et al., 2002; McElhinney et al., 2014)，并且能够诊断那些原本会被判定为不适合用DFA检测的标本(Prabhu et al., 2018)。对于在不同储存条件下长期保存的样本，RT-PCR在检测狂犬病病毒方面优于小鼠接种试验(Lopes, Venditti, & Queiroz, 2010)，并且由于动物福利的考虑，现已成为首选方法。此外，在某些司法管辖区，当一只动物曾与人类接触但DFA检测结果为阴性时，必须用替代检测来确认该结果；由于分子学方法比病毒培养或MIT完成得更快，且具有更高的敏感性，它们对于DFA检测结果的常规确认极为有用(Picard-Meyer et al., 2004)。当观察到意外或不寻常的荧光染色模式并需要确认病毒存在时，基因检测也可作为DFA检测的辅助手段；有时需要结合多种检测方法才能对特定病例的处理达成共识(McColl et al., 1993)。然而，当像RT-PCR这样的基因检测是唯一提示存在狂犬病病毒的方法时，这些检测之间结果不一致的问题可能很棘手。在这种情况下，区分RT-PCR的假阳性结果与其他检测的假阴性结果可能是一个高度复杂且没有明确解决方案的过程。最佳的补救办法是通过遵守PCR操作推荐的指南来尽可能避免这种情况(Cooper & Poinar, 2000)。这些指南包括：在每个病例中使用清洁、无菌的器械和用品仔细处理组织；使用物理上独立的区域进行组织提取、PCR和PCR后分析；在每个区域使用专用的移液器以避免样本交叉污染。