广谱狂犬病毒疫苗研究的最新进展（3）

目前丽沙病毒属的病毒，即狂犬病毒和狂犬病毒相关病毒，总共发现有大约18种，可细分为三个遗传谱系（phylogroups）。现有狂犬病毒疫苗是用经典的狂犬病毒（RABV）制备的，只能针对遗传谱系１的病毒提供较好的免疫保护作用，而对遗传谱系2和3的病毒则效果可能不佳。为了确保人类完全免除所有类型狂犬病毒的危害，有必要开发广谱狂犬病疫苗，能针对各种类型的狂犬病毒都发挥免疫保护作用。由于基因１型狂犬病毒（RABV）以外的17种丽沙病毒绝大多数都以蝙蝠为宿主，目前已知它们对人的危害很罕见，所以长期以来对此类疫苗研发的需求和动力不足，因而经费来源有限，进展缓慢。

近期美国费城杰弗逊大学和美国ＣＤＣ的研究人员合作在广谱狂犬病毒疫苗研究方面取得重要进展，他们的研究论文于7月21日在线发表在《Cell Reports （细胞报告）》杂志上。现将该论文的主要内容进行摘译（因内容较多，分数次发布）。

含嵌合糖蛋白的丽沙病毒疫苗具有跨遗传谱系的保护作用

(Lyssavirus Vaccine with a Chimeric Glycoprotein Protects across Phylogroups)

图2. 丽沙病毒嵌合G疫苗的构建与恢复

(Ａ)病毒基因组构建示意图。

BNSP333　是基于RABV　SAD B19株的亲本疫苗载体。其G位于固有的第4位，包含R333E减毒突变。

BNSPDG　基于BNSP333，但缺乏原生的G。以下所有的实验构建都基于BNSPDG。

rRABV　在第二位置包含按人类密码子优化(c.o.)的含R333E减毒突变的RABV G。

rMOKV　在第二位置包含按人类密码子优化（c.o.）的MOKV G。

rChimera1 (LyssaVax)　在第二位置含有带R333E减毒突变的嵌合G 1。

rChimera2　在第二个位置包含嵌合G2。　　

讨论（二）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

疫苗诱导的抗体反应

我们对LyssaVax疫苗产生的抗体反应感兴趣，因为抗体水平可反映疫苗引发的免疫反应的强度。ELISA结果显示，LyssaVax可诱导高滴度的抗MOKV G和RABV G的IgG抗体。用rRABV 和rMOKV免疫获得的血清包含较高滴度的抗体,它们可结合异种抗原(例如，用 rMOKV免疫14天后的老鼠血清能与RABV G结合)。然而,ELISA检测的是多种抗体,不考虑功能(例如,有中和活性和无中和活性的都能检测到)。此外，ELISA中使用的抗原是经洗涤剂处理可溶解的，这可能会暴露出在完整的活病毒粒子上原本难于接近的表位。

只有较少的一部分抗体在中和病毒中起作用，而这些VNAs（病毒中和抗体）的高滴度是预防RABV感染的最重要保证(世界卫生组织，2017)。因此，除了全程接种疫苗，狂犬病免疫球蛋白(RIG)的接种是当前PEP（暴露后预防）中提供短期被动免疫的一个关键组成部分。以rRABV或rMOKV的免疫接种作为对照，LyssaVax免疫的小鼠血清中和RABV CVS-11株和MOKV G 假型病毒（pseudotypes）的能力几乎在同一水平。尽管LyssaVax免疫后在第28天和35天RABV　VNAs 的水平低于对照，但在第56天之后它们的数值是相当的。此外，在第35天，LyssaVax免疫达到的滴度比0.5 IU/mL的保护阈值平均高出60倍以上，证明了LyssaVax具有诱导VNAs的强大功能。源于rRABV和rMOKV对照的血清在RFFIT和PTV（pseudotype viruses，假型病毒）中和试验中仅有最低限度的交叉中和反应，而且只有在较晚的时间点才会出现这种情况。

在建立了针对该组分病毒的强大功能抗体反应后，我们设计了免疫原性研究来评估与其他丽沙病毒的交叉中和反应。

考虑到该疫苗针对非组分病毒的VNA滴度可能降低，我们在LyssaVax和对照疫苗rRABV中加入toll样受体4 (TLR4)激动剂GLA-SE（一种新型疫苗佐剂）。lyssavax免疫血清中和了所有测试的病毒;在遗传谱系I病毒中，lyssavax诱导的血清中和效果明显低于rRABV对照疫苗，而对于DUVV，需要添加GLA-SE（疫苗佐剂）才能在大多数样本中实现中和。在针对遗传谱系II 病毒的效果试验中，LyssaVax + GLA-SE诱导的VNA滴度最高，针对MOKV和LBV D，未加佐剂的LyssaVax甚至明显高于rRABV + GLA-SE（佐剂）。微量中和试验的两个结果令人惊讶：LyssaVax对遗传谱系I中的非RABV 病毒产生相对较低的VNA滴度，而rRABV，无论带或不带GLA-SE，都能诱导针对LBV-B、LBV-D和SHIBV的交叉中和VNA。对于遗传谱系I的低VNA滴度，LyssaVax中源于MOKV G核心区域的抗原位点可能对遗传谱系I中的非RABV 病毒的中和更重要。

在一项用抗RABV单克隆抗体针对RABV 的一组毒株和丽沙病毒进行的测试中，5种单克隆抗体中没有一个与EBLV-1或DUVV结合，而且在先前报道的RABV G/MOKV G嵌合疫苗试验中，抗EBLV-1和DUVV的VNA滴度也最低。这些数据表明，为了全面覆盖遗传谱系I和II，LyssaVax可能需要来自遗传谱系I的不同病毒的成分。也有研究表明，较高浓度的抗RABV血清对于中和遗传谱系I中的非RABV 病毒是必要的，因此LyssaVax的RABV  G特异性滴度可能不够高。在LyssaVax中加入GLA-SE 能够提高针对遗传谱系I 病毒的VNA滴度，这个结果与上述看法也是一致的。

虽然丽沙病毒属的遗传谱系划分是基于遗传和抗原聚类，但也有许多抗原性连续变化即离散度较低的例子。例如,跨遗传谱系的中和,在RABV免疫的具有异常高VNA滴度的实验室工作人员中就曾观察到。至少有两个例子表明，抗RABV G单克隆抗体可交叉中和MOKV。此外，抗原制图（cartography）研究已经确定，丽沙病毒 Gs之间只有67%的抗原差异可以从氨基酸序列中预测。

在LyssaVax具有交叉中和作用的情况下，尚不清楚血清中是否含有单独的交叉反应抗体，或是否有离散的抗体群与每种抗原结合;这两种可能性都可能起作用。这个问题只能通过分离和鉴定单克隆抗体来解决，这是未来研究的目标。了解生理相关抗体与RABV以外的丽沙病毒Gs相结合的位置，对于详细研究LyssaVax如何激发针对多种丽沙病毒的保护性抗体将是非常重要的。

针对狂犬病的保护

LyssaVax所含嵌合G来源于两种组成病毒，由于产生了针对这两种病毒的高滴度VNAs，我们预期能提供完全保护。LyssaVax确实保护了所有感染RABV或rMOKV的小鼠，没有观察到体重减轻或临床症状。

虽然丽沙病毒通常是经颅内注射接种，但本研究选择i.n.（intranasal，鼻内）途径接种，有几个原因。首先，在致病性研究中，我们观察到雌性小鼠具有一致的致病性。第二，rMOKV在i.m.（肌肉内）途径接种时不具有致病性，这与对WT（野生型）MOKV的研究一致。第三，i.n.途径已被证明是可接受的替代颅内注射方法用于RABV攻毒试验。最后，i.n.途径接种对实验室人员的风险较小。

在对照组中，免疫和攻毒采用同源疫苗/病毒的小鼠如预期的都存活，而某些小鼠用异种病毒攻毒也存活。这是令人惊讶的,因为尽管用ELISA检测时抗体针对异种病毒Gs的滴度相当高，用rMOKV免疫的小鼠对RABV的中和滴度非常低，而rRABV也不能中和MOKV G假型病毒。然而,根据rMOKV血清能交叉中和遗传谱系I中RABV以外的其他病毒,某些小鼠用异种病毒攻毒也存活也是可以理解的。

值得注意的是，2只小鼠经rMOKV免疫后体重下降并被实施了安乐死，用rRABV免疫的2只小鼠在用rMOKV攻毒后体重下降并最终恢复。非典型攻毒模型(减毒株采用i.n.接种)可能是原因;这可以通过WT（野毒株）攻毒实验来解决。考虑到9/10的模拟免疫小鼠被安乐死，第10只小鼠确实在感染后存活，尸检检测到RABV VNAs，我们用２张图显示被成功感染的２只小鼠。

发展能中和丽沙病毒的广谱的 VNAs 的机制还没有被研究，已提出了关于丽沙病毒之间的抗原关系以及如何提供保护的重要问题。在没有中和抗体的情况下，可能有额外的、未明确鉴定的免疫机制有助于提供保护。对这种可能性值得进一步调查。

结论

我们提出了一种以单一嵌合糖蛋白为特征的丽沙病毒疫苗，该疫苗是根据对丽沙病毒 G结构的预测而设计的。嵌合的G保留了组分病毒 (RABV和MOKV)Gs的抗原特征和细胞感染功能。当作为灭活疫苗制剂使用时，它刺激产生高滴度的中和抗体，能对抗所含G蛋白的来源病毒和一些额外的丽沙病毒。

最后，LyssaVax被证明可以抵抗RABV和重组MOKV的攻击。尚需要进一步改进以提高针对遗传谱系I病毒的VNA滴度。我们建议，随着进一步的开发，这种疫苗可在丽沙病毒爆发期间使用，或在非RABV丽沙病毒流行的地区替代现有的狂犬病疫苗。

（全文完）

参考文献：

Fisher et al., Lyssavirus Vaccine with a Chimeric Glycoprotein Protects across Phylogroups, 2020, Cell Reports,  32, 107920　July 21, 2020 　https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107920

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