广谱狂犬病毒疫苗研究的最新进展（2）

目前丽沙病毒属的病毒，即狂犬病毒和狂犬病毒相关病毒，总共发现有大约18种，可细分为三个遗传谱系（phylogroups）。现有狂犬病毒疫苗是用经典的狂犬病毒（RABV）制备的，只能针对遗传谱系１的病毒提供较好的免疫保护作用，而对遗传谱系２和３的病毒则效果可能不佳。为了确保人类完全免除所有类型狂犬病毒的危害，有必要开发广谱狂犬病疫苗，能针对各种类型的狂犬病毒都发挥免疫保护作用。由于基因１型狂犬病毒（RABV）以外的17种丽沙病毒绝大多数都以蝙蝠为宿主，目前已知它们对人的危害很罕见，所以长期以来对此类疫苗研发的需求和动力不足，因而经费来源有限，进展缓慢。

近期美国费城杰弗逊大学和美国ＣＤＣ的研究人员合作在广谱狂犬病毒疫苗研究方面取得重要进展，他们的研究论文于7月21日在线发表在《Cell Reports （细胞报告）》杂志上。现将该论文的主要内容进行摘译（因内容较多，分数次发布）。

含嵌合糖蛋白的丽沙病毒疫苗具有跨遗传谱系的保护作用

(Lyssavirus Vaccine with a Chimeric Glycoprotein Protects across Phylogroups)

结果

基于结构设计嵌合丽沙病毒糖蛋白

图1. 基于结构的嵌合丽沙病毒糖蛋白设计

(A－ C)　丽沙病毒糖蛋白(G)胞外区域单体的结构模型。

(A)突出显示丽沙病毒G结构区域的的代表性结构模型(黄色表示clip区，橙色核心区，红色flap区)。嵌合Ｇ１(B)和嵌合Ｇ２(C)中，clip区用白色显示，核心（core）区和flap 区分别用蓝色或红色表示，对应(E)和(F)中的示意图。

(D–F) 　(D)线型图代表丽沙病毒 G单体，RABV G / MOKV嵌合Gs命名为嵌合G 1 (E)和嵌合G 2 (F)。在(D）中，提议的结构域的胞外域用颜色标记(clip黄色,核心橙色, flap红色),它们是已知存在于RABV G上的抗原位点:位点I(氨基酸残基224－ 229)，位点II(34－ 42和198－200)，位点III(330- 338)，位点IV(263 －264)和较小的位点 ‘‘a’’ (342–343)。

R333E，RABV G在残基333的减毒突变。

TM，跨膜区。

嵌合糖蛋白具有功能并支持病毒复制（具体内容略，下同）

LyssaVax疫苗经肌内和鼻内途径接种是不致病的

LyssaVax诱导针对RABV和MOKV的高滴度抗体

LyssaVax诱导针对RABV 的中和抗体

LyssaVax引发的抗体能中和MOKV G伪型病毒（Pseudotypes）

LyssaVax能抵御RABV和rMOKV的致命挑战

LyssaVax诱导的抗体能中和多种野型（WT）丽沙病毒

讨论（一）

嵌合G蛋白疫苗的基本原理

有各种各样的方法来扩大疫苗的保护范围，其中一些已被尝试用于丽沙病毒。一种直接的方法是制造多个疫苗结构，每个都表达一种单独的丽沙病毒 G ，但是这种策略会使已经被认为对最需要它的地区过于昂贵的疫苗的成本再增加一倍。此外，一种丽沙病毒 G可能比其他的具有免疫优势。有人提出接种采用活载体来制备丽沙病毒疫苗;此类疫苗虽然在野生动物狂犬病疫苗接种活动中更便宜，也更成功，但出于安全原因，不太可能被批准用于人类。

另一种方法是在单一疫苗结构中添加多个G蛋白的成分。外源病毒Gs已成功添加到RABV基因组中，其Gs表达量与原来的RABV G相当。然而，含有多株丽沙病毒 Gs的重组病毒的稳定性还没有经过严格的测试。根据我们的经验，丽沙病毒的Gs各自表现出不同的生长速度和表达水平。我们的初步数据表明，当在单一载体中组合时，效率较低的G对重组病毒有不利影响，并对重组病毒造成选择性压力，使其失去G蛋白的表达，从而导致该病毒生长较慢。因此，我们提倡使用含单个Ｇ蛋白的丽沙病毒疫苗。

在最近发表RABV G晶体结构之前，我们的蛋白设计工作受益于相关弹状病毒科的VSV（vesicular stomatitis virus，水疱性口炎病毒）的预融合G结构。VSV G的结构使我们能够重新审视嵌合体策略，设计一种更新的嵌合丽沙病毒 G，并生成具有相关功能的病毒。此外，尽管缺乏关于非RABV丽沙病毒 Gs抗原区域的详细知识，我们还是谨慎设计了一个嵌合G，其中潜在的抗原位点在两个主要区域之间保持平衡。位点II和III可能是最重要的，因为它们分别与两个公认的RABV细胞受体：烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)和低亲和力神经营养因子受体(p75 NTR)共享结合位点。尽管与II位点结合的G特异性单克隆抗体占很大比例，II位点通常被认为是最具有免疫原性的位点，然而实际上许多与I位点结合的单克隆抗体被开发用来取代PEP中的免疫血清。位点IV的免疫原性已经在小鼠、人类和犬中得到证实。源于不同种属动物的RABV抗体应答被认为没有显著差异。总之，我们认为基于域（domain）生成嵌合Gs的方法是一个更好的选择。

丽沙病毒Gs之间糖基化位点不同：RABV G在残基37、247和319处有3个预测的n-链糖基化位点;MOKV G共享n319位点但只有另一个预测的n202位点。因此，嵌合G1有两个预测位点：N202和N319。N319位点在丽沙病毒中保守，被认为是成熟和通过内质网和高尔基体运输所需的最小位点。N37已被证明不能有效地糖基化，而且对于正确的G折叠和功能来说可能是不可缺少的。最后，已经提出MOKV G中的N202位点在体内没有糖基化。虽然嵌合物G的糖基化位点需要进一步的研究来确定，但是我们的数据与被引的工作是一致的，因为我们没有观察到糖基化影响LyssaVax抗原性的证据。

含嵌合G的病毒活性的恢复

尚不清楚为什么嵌合G 2不能使病毒恢复。作为单一的表面蛋白，G完成了许多任务，包括三聚体化，与细胞受体结合，以及介导膜间融合，这些都可能被新的重组蛋白打乱。转染细胞的免疫荧光显示，嵌合的G2被成功地生产、运输到细胞表面，并显示出预期的抗原性，这表明功能而不是结构问题阻碍了病毒活性的恢复。

无论如何，嵌合G1是嵌合G疫苗的一个较好的选择，因为它包含了RABV G贡献的flap区域内的减毒突变R333E(图1E)。RABV G中的R333残基与一个假定的RABV细胞共受体，低亲和神经营养蛋白受体，p75 NTR的联系是至关重要的。在成年小鼠中，仅R333E突变通过外周感染途径丧失致病性，可能导致两种途径检测的LyssaVax的失活。

参考文献：

Fisher et al., Lyssavirus Vaccine with a Chimeric Glycoprotein Protects across Phylogroups, 2020, Cell Reports,  32, 107920　July 21, 2020 　https://doi.org/10.1016/j.celrep.2020.107920