冠状病毒的复制/转录体

作者：郝炜

冠状病毒广泛存在于自然界中，宿主涵盖鸟类及多种哺乳动物（包括人类）。在相当长的时间里，这类病毒并未引起人们的注意，对其研究也极为有限，主要原因是被认为其对人类公共健康安全的威胁不大，仅仅少数病毒家族成员（HKU1，NL63，229E以及OC43）能引起轻度的呼吸道感染症状。直到2002-2003年SARS疫情的出现，彻底颠覆了人们对该病毒家族的认识，而对该类病毒的研究也一度成为热点。在SARS暴发后的十余年里，人们对冠状病毒的研究取得了一系列进展，包括SARS冠状病毒在人类宿主中的受体识别机制以及一系列病毒重要蛋白的结构与功能的阐明。但是，2012年，与SARS病原体极为相似的MERS疫情在中东重新暴发，一度波及到韩国甚至中国，再次引发了重大的公共健康安全事件。MERS的暴发至少提示了两点：1.冠状病毒在自然界中存在广泛，宿主复杂，因此类似SARS与MERS的疫情完全可能在未来的任何时间任何地点卷土重来；2.尽管目前对冠状病毒的研究已取得了很多进展，但对其相关的机制仍然需要进一步彻底阐明，起码目前还没有关于针对该类病毒的有效药物或疫苗的研究成功报道。

近年来关于冠状病毒尤其是SARS与MERS的研究进展，主要集中在病毒如何识别并进入宿主细胞的机制（如SARS、MERS的S蛋白识别宿主细胞的机制等）以及病毒进入胞内后如何进行转录复制机制这两大领域。但是目前关于后者的研究远不如前者清楚，主要原因是冠状病毒的复制转录过程参与的蛋白更多，过程更复杂。这些参与的蛋白包括病毒编码的至少7个以上非结构蛋白（non structural proteins, NSP），甚至也包括一些暂时未知的宿主蛋白，这些蛋白与病毒模板RNA通过直接或间接相互作用，形成一个较大的蛋白/核酸复合物，被称为复制/转录体（replication/transcription complex, RTC）。

冠状病毒RTC模型

L.Subissietal./AntiviralResearch101(2014)122–130

病毒属于最简单的生命形式，大部分的病毒基因组结构极其简单，其复制转录过程一般都是尽量利用宿主蛋白帮助完成。而冠状病毒拥有如此多的自身表达蛋白参与其复制转录过程，这在病毒界中绝对属于“豪华配置”。而对应的，冠状病毒本身的基因组，是一条约27kb-32kb的正链RNA，这在病毒界中也属于“鹤立鸡群”。该基因组RNA拥有5’帽子结构以及3’端多聚腺苷酸（poly A）尾部，与真核生物的mRNA特点相似。参与冠状病毒复制转录的非结构蛋白由病毒基因组RNA 5’端2/3部分编码，该区域被称为编码框1ab（ORF1ab）。ORF1ab又前后分为两段,分别称为：ORF1a与ORF1b。两个编码框分别表达长链的多肽，再经由病毒自身表达的蛋白酶进行剪切加工，最终形成各个独立折叠的非结构蛋白。其中参与组装形成复制转录体的蛋白，NSP7、NSP8和NSP10是ORF1a的编码产物；NSP12、NSP13、NSP14与NSP16是ORF1b的编码产物。

目前对于这些参与组装复制转录体的非结构蛋白的结构与功能研究已有不同程度的进展：

如NSP12与NSP13相互作用，形成RTC的核心部分。其中NSP12分子量很大，是典型的RNA聚合酶，具有该类聚合酶最保守的序列特征。但是在体外实验中，NSP12只有非常弱的RNA聚合酶活性，只有在另外两个较小的非结构蛋白，NSP7与NSP8参与下，才具有RNA聚合酶全酶活性。

NSP13是解旋酶，属于解旋酶第一类家族成员，具有依赖ATP水解酶活性，从5’-3’方向解链双链RNA和DNA的功能，其N端是一个特征性的锌结合结构域。

NSP14具有双重功能，其N端具有3’-5’核酸外切酶活性，C端则具有N7鸟苷酸甲基转移酶活性（N7-Mtase,该酶活性与核酸加帽反应有关，同时也可增强核酸外切酶活性）。

NSP16具有2’-O甲基转移酶活性（2’-O-MTase）,应该也是参与核酸5’帽子结构形成。

NSP10被称为分子转换器（molecularswitch）,能够与多种NSP蛋白形成复合物，如NSP14，NSP16等，它本身也具有单体和同源二聚体两种形式。最新报道的SARS病毒NSP10-NSP14复合物结构与功能显示，NSP10能够激活NSP14的核酸外切酶活性。

可以确定，参与冠状病毒RTC的蛋白绝不仅限于以上几种，实际参与复制转录过程的蛋白数量应该更多，功能也更多样化。参与形成RTC的NSP蛋白在冠状病毒家族中普遍非常保守，是设计抗冠状病毒药物的理想靶点，但目前对这类蛋白结构与功能的理解仍然有限，尤其是构成RTC核心的NSP12、NSP13目前仍未获得必要的结构生物学信息。即使对单个参与的蛋白阐明其结构与功能机制，相比复杂的RTC复合物活动来说，仍然只是揭开其冰山一角。只有阐明整个RTC结构中，各个蛋白如何相互协作以及与核酸之间的相互作用，才能真正揭示冠状病毒的复制转录机制，这对传统的晶体结构学无疑是巨大的挑战，但近年来突飞猛进的冷冻电镜技术有可能更适合挑战这个目标。

参考文献：

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3   L. Subissi, I. Imbert, F. Ferron, A. Collet,B. Coutard, E. Decroly, and B. Canard, 'Sars-Cov Orf1b-Encoded NonstructuralProteins 12-16: Replicative Enzymes as Antiviral Targets', Antiviral Res, 101 (2014), 122-30.

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