抗病毒新药莫努匹拉韦的具体作用机制

本文为读后感，原文见文后，读后感作者：李子恒

自新冠疫情爆发以来，科学家们开发各种疫苗和药物，取得了不同程度的成功。其中最受关注的抗病毒药物瑞德西韦（Remdesivir），瑞德西韦的具体作用机制为，它以前药(Prodrug)形式进入细胞后，通过三步转化为三磷酸代谢物并与天然ATP竞争结合病毒RdRp，使错误的核苷酸插入RNA合成链中，抑制RdRp酶活性导致引起病毒RNA合成终止。但是在随后的临床实验中也表明瑞德西韦在体内的抗病毒作用很弱。

莫那比拉韦是另一种抗病毒候选药物，最初是为了治疗流感而开发的。由于在感染早期病毒快速复制，而宿主的免疫系统尚未有足够的时间建立免疫防御，所以抗病毒药物治疗阻断病毒的最佳时间是在感染的前几天。而Molnupiravir正是设计用于疾病早期门诊使用，且为口服胶囊，所以受益人群将会大大增加。莫那比拉韦以于2021年8月9日作为新药在澳大利亚成功上市。

Molnupiravir的作用机制与瑞德西韦类似，当它以前药的形式进入细胞后，代谢生成其的活性形式是β-D-N4-羟基胞苷（NHC）-三磷酸MTP，在病毒RNA合成过程中加入该分子会导致随后的碱基对误读，MTP通过与CTP的竞争，导致病毒的RdRp会错误使用MTP，从而导致高突变率和最终的基因组的致死率。尽管全世界的研究者对取得了这些进展，但目前还缺乏对NHC RNA突变机制进行系统的生化和结构分析。本篇文章便是对莫那比拉韦的作用机制提供详细的介绍。

本篇文章的结构如下，作者设计了RNA伸长率测定试验，发现羟基胞苷磷酸盐能够掺入RdRp中。并且与瑞德西韦不同的是，在在掺入M后RNA链并不会停止，而是在RdRp的作用下继续延长。并且RdRp还可以使用M的RNA作为模板，酶随后可能会将错误的核苷酸掺入RNA链中，从而起到抑制病毒复制的作用。作者解析了RdRp与掺有M的RNA及其互补链的冷冻电镜结构，证实是上诉生化实验的可靠性。最终基于以上的实验结果作者提出了莫那比拉韦的具体作用机制模型。。

首先作者运用了刚才所讲的RNA伸长率测定试验作者使用重组SARS-CoV-2 RdRp和四种合成RNA模板产物双链，利用荧光标记定量。如图D和E所示的那样当+1位置为（G）或（A）时碱基M可以很容易掺入RdRp中并且与这两种核苷酸配对，这与先前在莫那笔拉韦在抗MERS-CoV的感染过中观察到的事实一致。然而，与正确的核苷酸C或U相比，病毒RdRp将M掺入RNA链的效率。

在结果二的部分，作者测定了当（M）掺入新生RNA是否会干扰RNA的进一步延伸。和之前一样，作者首先进行了RNA延伸分析，如图A所示，这一部分RNA链在掺入X后是可以让RNA进行四个核苷酸（nt）延伸的。作者观察到当M代替同源C或U的掺入后，并不能阻止致随后三个核苷酸的继续延伸长。为了进一步验证上诉的结果，作者设计了如图B的试验来测定 RNA延伸，这一模板在掺入X后允许加入11个nt（图2c）。在这种情况下，当三磷酸尿苷（UTP）或三磷酸胞苷（CTP）被MTP取代时的模板也同样能够继续延申下去。并且在d图可以看出，当M代替U的掺入比M代替C的掺入后，RNA的延长效率明显降低（图2d）。这些结果表明，M掺入新生RNA不会阻止RNA进一步延伸。因此，在MTP存在的情况下，RdRp可以合成含有M核苷酸的较长RNA产物。那么将含M的RNA用作模板时，病毒的RNA的转录是否生成含有突变的mRNA 呢

为了研究这一问题，作者合成制备了含M的RNA通过变性HPLC和HR-ESI-MS确认获得的RNA中存在M以及RNA纯度（图3b）。在退火后，使M占据模板位置+1。

延伸率分析表明，模板链+1位置的M残基定向将G或A掺入新生RNA，类似的RNA双链体稳定性略低于含有C-G碱基对的双链体（扩展数据图2和补充表2）。因此，当RdRp使用含有M的RNA作为模板时，正确或错误的核苷酸被并入RNA产物中，从而发生突变。

上述数据表明，突变机制的关键方面是在RdRp活性中心形成稳定的M-G和M-A碱基对。为了进一步完善这一模型，作者解析了两种RdRp–RNA复合物的结构，在模板链中含有M，在产物链的3′端含有G或A。

在RdRp–RNA结构中，该结构在位置上包含M-A或M-G碱基对。且总分辨率分别为3.3Å和3.2Å，比较两种结构相互之间以及与原始RdRp–RNA结构和含Remdisvir的RdRp–RNA结构之间没有显示出重大差异， 通过对M-A或M-G碱基对的建模，可以很容易地看到结构的位置（图4b，c）。然而，观察到的氢键几何结构不是最优的，这可能解释了我们的生化观察结果，即M可以很好地模拟C，并且在某种程度上模拟U，但这两种模拟都不是完美。这一结构表明稳定的M-G和M-a碱基对可以在RdRp活性中心形成和调节，解释了作者上诉的生化结果。

综合上诉的结果，作者提出了莫那比拉韦的具体作用机制，既当它进入细胞时，它被转化为类似RNA的构成单元。在第一阶段，称为RNA聚合酶的病毒复制机器将这种构成单元整入SARS-CoV-2的RNA基因组。然而，与延缓病毒RNA聚合酶的瑞德西韦不同的是，莫那比拉韦并不直接干扰这种病毒复制机器的功能。相反，在第二阶段，这种类似RNA的构成单元与病毒遗传物质的构成单元相连接在一起，将错误的碱基掺入到RNA中去，进而导致病毒翻译的错误，达到抑制病毒复制的目的。

原文链接：

Kabinger F, Stiller C, Schmitzová J, Dienemann C, Kokic G, Hillen HS, Höbartner C, Cramer P. Mechanism of molnupiravir-induced SARS-CoV-2 mutagenesis. Nat Struct Mol Biol. 2021 Sep;28(9):740-746. doi: 10.1038/s41594-021-00651-0. Epub 2021 Aug 11. PMID: 34381216; PMCID: PMC8437801.