科研笔记（—）

自己手动装填凝胶过滤层析柱

作者： 秦博

图一、凝胶过滤分离原理：空间排阻

凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)又称排阻层析或分子筛，是根据蛋白质等生物大分子分子量大小和形状进行分离和纯化的重要技术。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。由于直径较大的分子滞留时间短先流出，而直径较小的分子后滞留时间长而后流出。

  此方法是获取高质量高纯度重组蛋白的一个关键步骤，但目前各种凝胶过滤层析预装柱存在价格昂贵，易堵塞，易高压报警等问题，因此对于需要频繁使用凝胶过滤层析技术进行大批量高纯度蛋白质制备的的实验室来说，如果全部通过采购商品化的预装柱进行重组蛋白纯化，则需耗费大笔的实验经费。因此，根据市场的不同需求，为满足不同层次的客户，很多商家在出售商品化预装柱的同时，也会出售可以手动装填凝胶过滤层析柱的柱料(为保证商业利益，其柱料的微球孔径大于同等型号商品化预装柱中所用柱料微球孔径)和相关配件供客户自行选择。本研究小组在经过前期调研，学习相关填柱视频，咨询技术支持和不断的尝试摸索的基础上，现已建立了一套成熟的手动装填凝胶过滤层析柱的技术流程，虽然局限于所购柱料的微球孔径与商品化的预装柱所用柱料不一致，无法达到商品化预装柱同等的塔板数（自填柱的塔板数值为预装柱的三分之一左右，其中塔板数是检测凝胶过滤层析柱分离效果的一个指标，一个凝胶过滤层析柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。踏板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡），但对于获取结晶级别的重组蛋白已足够所用，且可降低至少十倍的实验成本。其中本研究小组发现通过改变一些参数和一些操作（比如缩短层析柱末端和下部检测器连接线的长度，在不超过柱料可耐受最大压力的条件下延长填柱的时间和增加填柱的流速梯度等）可以显著的提高凝胶层析柱的塔板数，且足以实现层析标准品的分离，下图为将商品化的层析蛋白标准品（bio-rad:1511901,出峰位置蛋白分子量依次为）采用商用预装柱和自填柱进行凝胶过滤层析分离所获得的结果，可看出自填柱完全可以实现标准品的分离。因此，通过采用此方法可以在不影响实验结果的前提下为实验室节约一笔可观的课题经费。

图二、预装柱层析标准品分离效果图

图三、自填层析标准品分离效果图