Sirt5是SARS-Cov-2的前病毒因子，可以与Nsp14相互作用 

 本文为读后感，读后感作者：王临岳，原文链接见文后。

 背景 

      随着新冠疫情在全球的爆发和蔓延，关于SARS-CoV-2的研究显得至关重要。众所周知，SARS-CoV-2 基因组的大小约为30 kb,主要包含两个编码框，orf1a和orf1b。可编码出pp1a和pp1ab两个前体蛋白，经蛋白酶水解后，可生成16个具有生物学功能的非结构蛋白，这16个蛋白主要参与病毒复制，转录和翻译等过程，并在各冠状病毒间高度保守。 

      其中Nsp14主要是通过与Nsp10相互作用形成稳定的复合物发挥它们的生物学功能。Nsp14主要有两种催化活性，一是N端结构域的3′到5′外切酶活性，二是C端结构域的N7甲基转移酶活性。外切酶活性的存在，确保了病毒RNA复制过程的高保真性，而甲基转移酶活性则在稳定病毒mRNA以及抗病毒免疫逃逸方面具有重要作用。值得一提的是Nsp10与Nsp14的结合能够稳定Nsp14的外切酶催化结构域，提示其对于Nsp14的外切酶活性是十分必要的。 

      已有研究表明Nsp14可以与人去乙酰化酶5（SIRT5）发生相互作用。Sirt5是Sirtuin家族成员之一，Sirtuin蛋白是一种从细菌到人类都高度保守的去乙酰化酶类，主要包括7个成员：Sirt1-Sirt7，它们都具有高度保守的NAD+结合域和催化功能域。虽然SIRT5蛋白利用NAD作为底物执行弱蛋白脱乙酰酶作用，但其能够有效地从蛋白质中去除长链酰基，例如琥珀酰、丙二酰、戊二酰等基团。因此SIRT5作为主要的细胞去琥珀酰酶、去丙二酰酶和去戊二酰酶发挥其作用。 

 结果 

      首先，作者通过在HEK-293T细胞中过表达Nsp14-strep蛋白，通过Co-IP等实验验证了在细胞内，Nsp14可以与SIRT5相互作用；并通过荧光共定位实验，证明Nsp14和SIRT5在细胞中主要共定位于胞浆内与核周附近的区域。 

      前文背景部分提到，Nsp14主要通过与Nsp10形成复合物发挥作用，因此作者想进一步证明Nsp14、Nsp10、SIRT5三者之间的相互作用的关系。Co-IP的结果显示，Nsp14能够同时与Nsp10和SIRT5互作，但Nsp10与SIRT5不存在相互作用关系。因此，这两者之间可能存在竞争关系，可能竞争性地结合Nsp14蛋白。 为验证Nsp10与SIRT5竞争结合Nsp14的假设，使用Nsp14、SIRT5与不同浓度的Nsp10质粒共转染Sirt5-KD细胞。然后进行Co-IP实验，验证三者之间的竞争性结合的关系，结果显示，在转染了高浓度Nsp10质粒的情况下，SIRT5与Nsp14的结合存在抑制，提示Nsp10与SIRT5确实存在竞争性结合Nsp14的现象。 

      为确定Nsp14与SIRT5互作的机制。作者通过分析SIRT5的结构，确定了其酶活性中心的关键氨基酸位点（包括H158、Y102、R105、Q140和I142），并对这些位点进行突变，探究些位点是否影响SIRT5与Nsp14之间的相互作用。结果显示，与WT相比H158Y和Q140A会导致两者之间的相互作用完全消失；R105M和I142A会大大减弱两者之间的相互作用；而Y102F对两者之间的相互作用没有影响。以上这些结果提示SIRT5的催化结构域在与Nsp14的互作中发挥了关键的作用。

      为进一步验证SIRT5催化活性对于二者相互作用的影响，研究者将Nsp14与SIRT5共转染的Sirt5-KD细胞与浓度逐渐增高的SIRT5抑制剂共同孵育。Co-IP结果显示，高浓度的SIRT5抑制剂会使二者的结合能力丧失。作者还探究了SIRT5的底物浓度即细胞内NAD水平是否对它们之间的相互作用产生影响。研究中使用FK866和NMN两种物质制造细胞内不同的NAD水平。单独添加FK866时，细胞内NAD水平降低，单独添加NMN时细胞内NAD水平升高，两者同时添加时细胞内NAD水平维持正常状态。Co-IP实验结果表明Nsp14与SIRT5的结合与细胞内NAD水平呈正相关。上述三个实验再次确认了SIRT5催化活性在与Nsp14互作中的重要性。 

      因为整个SIRT家族共包含7个成员，且它们之间的酶活性存在一定的保守性，因此，在前期研究结果的基础上，作者对于剩余六种SIRT蛋白进行测试。探究它们是否也能与发生Nsp14互作，发现SIRT1能与Nsp14结合但其结合能力要弱于SIRT5。对SIRT1进行关键位点突变以及添加SIRT1抑制剂，发现都能使其与Nsp14的结合能力丧失。 为确证Nsp14和SIRT5互作后双方对各自酶活性的影响，研究者将不同比例的Nsp14与SIRT5共同孵育，分别对SIRT5和NSP14的两种酶活性进行验证。两组实验表明Nsp14与SIRT5所形成的复合体对于两种蛋白各自的酶活性均不产生显著的变化。 

      为验证SIRT5是否是一种前病毒因子，研究者使用CRISPR-Cas9技术构建了Sirt5-KO的A549细胞，并同时在细胞内过表达ACE2蛋白。使用MOI值为0.1和1的两种新冠毒株分别感染野生型和Sirt5-KO细胞。3天后，对病毒mRNA的RT-qPCR结果以及细胞的噬斑实验结果分析表明病毒的mRNA转录以及病毒滴度在Sirt5-KO细胞中都有着显著的下降，这提示了SIRT5对新冠病毒的复制或传播是十分重要的。

       为验证上述实验的结果，研究者在用病毒感染过表达ACE2蛋白的A549细胞的同时添加了SIRT5抑制剂。结合RT-qPCR以及病毒噬斑实验结果分析表明病毒的复制能力与毒性皆显著下降。这两个实验证明SIRT5确实对SARS-CoV2的感染具有促进作用。 

       为了确定SIRT5发挥它前病毒因子的作用是否是通过与Nsp14的相互作用来实现的，又因为SIRT5不与来自OC43病毒的Nsp14蛋白发生互作。因此，作者分析了SIRT5在感染人类冠状病毒HCoV-OC43期间的作用，在细胞感染OC43病毒的同时加入SIRT5抑制剂，结果发现病毒的复制能力与毒性同样下降，这一观察结果表明SIRT5在感染过程中的作用可能部分独立于其与 Nsp14的相互作用。 

       以上就是该文章涉及到的主要实验分析结果。 

 参考文献：

 https://doi.org/10.1101/2022.01.04.474979 

SIRT5 is a proviral factor that interacts with SARS-CoV-2 Nsp14 protein