用于冷冻光电联用显微镜和双束扫描电镜的原位基准物

本文为读后感，原文见文后，读后感作者：张楚 

 细胞和组织的成像在过去的十年中有了显著的改善。安装在扫描电子显微镜(FIB-SEM)上的聚焦离子束的双光束仪器，提供大体积和视场的高分辨率三维成像，正在生命科学中得到广泛的应用。FIB-SEM电镜最近已在完全水合、低温固定化的生物样品上实现。结合荧光显微镜(FM)与FIB-SEM成像的相关光和电子显微镜工作流程存在，而结合低温FM和低温FIB-SEM成像的工作流程还没有普及。这篇文章中，作者证明了荧光标记的脂滴可以作为相关的低温-FM和FIB-SEM数据集的原位基准标记，并且这种方法可以用于在低温条件下获得跨越几十微米的大型FIB-SEM堆栈。作者表明，低温FIB-SEM电镜成像对于与细胞器结构和细胞器间接触、核组织和细胞内矿物沉积相关的问题具有特别丰富的信息。

1. 低温FIB-SEM电镜下各个细胞器能够被识别。

作者将哺乳动物细胞铺在载网上制备FIB-SEM冷冻切片，在FIB-SEM下可以看到各个细胞器的形态

图1：冷冻FIB-SEM观察哺乳动物细胞切片可看到各个细胞器

2. 脂滴可以用作光电联用显微镜基本标记物

将脂滴用BODIPY(493/503)染色，在cryo-FM显微镜下可观察到脂滴带绿色荧光且在细胞中广泛分布，通过仿射变换可发现脂滴在FM和FIB-SEM的定位准确，误差仅在纳米级，可用作基准物辅助定位。

图2：以脂滴为基准标记物的三维相关性

3. 低温FIB-SEM可作为研究三维细胞超微结构的工具

通过使用脂滴作为基准物，在FIB-SEM电镜下可观察到线粒体间的结构和线粒体内部颗粒，以及细胞核相关结构及核膜内陷等现象

图3：FIB-SEM观察线粒体间和内组织

图4：通过FIB-SEM显示的核组织

    结论：作者证明了使用细胞器作为FIB-SEM的基准标记，作为标本外部基准标记的替代方法。具体来说，作者展示了脂滴作为相关性的基准的有用性。虽然在本研究中使用了BODIPY染色，但也可以使用其他红色和远红色波长的中性脂质染料。结合突出特定瞬态过程或状态的荧光报告器，该工作流程可以用于解决细胞生物学中的不同问题，在这些问题中，解决细胞在其固有状态下的超微结构组织是重要的。由于低温共焦和超分辨率FM已经实现和发展，它们可以在需要更高分辨率或更厚的高压冷冻样品时应用。FIB-SEM断层扫描显然是一种很有前途的不常用的成像方法。

原文：

Scher N, Rechav K, Paul-Gilloteaux P, Avinoam O. In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging. iScience. 2021 Jun 10;24(7):102714. doi: 10.1016/j.isci.2021.102714. PMID: 34258551; PMCID: PMC8253967.