​2021年7月13日，Nature Communication杂志在线发表了澳大利亚研究人员的最新研究成果，文章标题为“Reprogrammed CRISPR-Cas13b suppresses SARS-CoV-2 replication and circumvents its mutational escape through mismatch tolerance”。该研究通过使用CRISPR-Cas13b的基因编辑技术，从而抑制哺乳动物细胞中SARS-CoV-2病毒及其突变体的复制，为COVID-19疾病的治疗提供了有效的切入点。

之前的研究人员发现，原核生物中存在一种规律成簇的间隔短回文重复DNA 序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR)。CRISPR-Cas系统，就是CRISPR表达的非编码RNA（CRISPR RNA，crRNA）及其相关蛋白（CRISPR associated protein, Cas）组成的复合物在原核生物中形成一种能够抵御噬菌体和外来核酸入侵的防御系统。研究人员已经成功开发了CRISPR-Cas系统的家族成员Cas9和cpf1(又名：Cas12a)的基因编辑工具，这些系统具有RNA指导的DNA内切酶活性，具有重大应用前景并且已经成功用于人类细胞的基因改造。后来，新型的RNA指导的RNA内切酶-CRISPR-Cas系统Ⅵ型Cas13b蛋白也被成功开发应用，这种系统不仅具有pre-crRNA加工活性，同时还具备靶向RNA的切割活性，从而保护宿主抵抗病毒等外源RNA核酸物质入侵。

2019冠状病毒疾病(COVID-19)的病因--严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARSCoV-2)，截至2021年6月已在全球造成1.7亿人感染，380多万人死亡。尽管许多高效疫苗目前正在全球部署，但包括工程单克隆抗体和小分子抗病毒药物在内的有效治疗方法的进展却不太成功，特别是在治疗严重疾病或防止病情由轻到重的进展方面。因此，人们严重担心，新的SARS-CoV-2变异的快速进化和传播可能影响这种流行病的有效控制，并增加SARS-CoV-2成为地方性流行病的可能性。所以，寻找创新的预防和治疗方法迫在眉睫，以抵消SARS-CoV-2基因组的动态变化并阻止病毒逃逸。

在本研究中，作者采用全基因组计算预测和单核苷酸分辨率筛选，针对SARS-CoV-2基因组RNA和亚基因组RNA重编程CRISPR-Cas13b。经过重编程的效应蛋白CRISPR-pspCas13b靶向SARS-CoV-2刺突蛋白和核衣壳蛋白编码基因的RNA转录本的可访问区域，在HEK 293 T和VERO细胞中的沉默效果特异且高效（图1）。随后的研究发现，单个pspCas13b crRNA可以沉默SARS-CoV-2单碱基变异并克服突变驱动的病毒逃逸的潜力。效应蛋白CRISPR-pspCas13b可以有效抑制SARS-CoV-2 RNA在哺乳动物细胞中复制，并证明多重crRNA同时靶向SARS-CoV-2病毒RNA的多个区域，可以一定程度上解决单个crRNA靶向SARS-CoV-2的效果局限性。作者还提出需要建立一个pspCas13b全基因组SARS-CoV-2 crRNA文库，以沉默各种SARS-CoV-2亚基，并研究它们在这种新病毒的生物学中的作用。

图1 重编程pspCas13b设计思路

图2 pspCas13b通过crRNA多路复用和单核苷酸错配耐受从而抑制SARS-CoV-2变异及其进化的示意图

总之，本研究利用pspCas13b对单核苷酸错配的高度耐受和crRNA多路复用的使用（图2），发现重编程pspCas13b可以作为一种工具来有效沉默SARS-CoV-2毒株，而这些毒株之前可能逃避传统的抗病毒治疗，包括重组单克隆抗体，康复期患者血浆中的抗体，疫苗接种产生的抗体，或小的抑制剂分子。然而，实现这种实验数据的临床转化的关键步骤将是开发一种安全有效的给药策略，如用于全身或者粘膜给药脂质纳米颗粒制剂，这亟须动物模型试验来验证。另外， CRISPR-Cas13b的特异性、效率和快速部署特性为抗病毒药物开发提供了一个分子蓝图，以抑制和预防一系列SARS-CoV-2变体，并且也很容易适应和扩展到SARS-CoV-2以外的其他致病性病毒包括流感病毒、埃博拉病毒以及可能的HIV病毒，因此可能代表了一个强大的抗病毒治疗平台。

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撰文：候美琪

编辑：刘振兴

审核：张贤钦