2023年9月7日，荷兰乌特勒支大学Paulien Terhal等人在The American Journal of Human Genetics杂志上发表题为AXIN1 bi-allelic variants disrupting the C-terminal DIX domain cause craniometadiaphyseal osteosclerosis with hip dysplasia的文章，研究人员描述了一种伴有髋关节发育不良的硬化性骨病，是由AXIN1的纯合截短变异导致其C末端DIX结构域的缺失引起的。

研究背景

硬化性骨发育不良是由于成骨细胞骨形成增加导致骨质增生或破骨细胞缺乏骨吸收导致骨硬化。经典Wnt信号通过调节核β-catenin在骨稳态中起关键作用，该通路中发挥作用的基因发生缺陷会导致大量骨骼发育不良和骨量改变。配体与Frizzled-LRP5/LRP6受体复合物结合后，通过抑制其破坏复合体使β-catenin稳定。β-catenin破坏复合体是一个大的多蛋白复合物，由核心支架蛋白APC和AXIN1/2以及激酶GSK3和CK1组成。虽然成骨细胞分化在不同阶段受到经典Wnt信号的正向调节，但高水平的β-catenin会抑制破骨细胞分化。

AXIN1是β-catenin破坏复合体的主要协调者，将所有主要组成部分紧密相连从而极大地加速了β-catenin的磷酸化。AXIN1具有一个N端调节G蛋白信号(RGS)结构域、一个大的内在无序区(IDR)和一个C端Dvl-Axin相互作用(DIX)结构域。RGS结构域与APC相互作用，而IDR包含多个蛋白的结合结构域，包括β-catenin，GSK3b和CK1。DIX结构域介导AXIN1自聚合，这对于有效破坏复合物活性至关重要。此外，在Wnt激活的细胞中，DIX结构域与DVL形成聚合体以稳定β-catenin并激活Wnt通路。

研究结果

研究人员描述了来自4个家系的7位患者，所有患者的AXIN1基因在编码C端DIX结构域的的最后一个外显子中均存在纯合截短变异。7位患者都具有骨骼表现，包括骨硬化和骨质增生，以及大头畸形。常见的临床体征是髋关节脱位、贫血或全血细胞减少和心脏畸形。除其中一名患者外，其余患者均存在不同程度的发育迟缓(图1)。

图1.硬化性骨骼发育不良伴髋关节发育不良和不同程度发育迟缓的家系、遗传学发现和放射学表型         

随后研究人员检测了家系1患者的骨转换标志物水平，观察到RANKL/OPG比值降低和P1NP水平升高，并通过放射照相显示出了许多患者干骺端有粗大的骨小梁堆积。随后在14.5岁择期手术期间对患者F1-Ⅱ1进行了骨活检，组织学检查和组织形态计量学结果显示了成骨细胞活性较高(图2)。

研究人员为了探究AXIN1突变(p.Arg723*)对蛋白质丰度和基因调控的影响，使用识别N末端AXIN1表位的抗体进行免疫印迹，观察到残留的AXIN1 mRNA表达产生了低水平的截短蛋白。

AXIN1的同源物AXIN2的表达受经典Wnt信号调控。在基础细胞培养条件下，研究人员发现患者皮肤成纤维细胞中AXIN2表达和非磷酸化的β-catenin蛋白水平升高。这些发现表明在AXIN1截短蛋白数量减少的成纤维细胞中，经典Wnt通路活性增强(图3)。

图3.AXIN1p.Arg723*在皮肤成纤维细胞中的致病性

为了研究AXIN1变体p.Arg723*，p.Val799Glyfs*4和p.Arg805*是否影响DIX结构域的完整性和点状结构的形成，研究人员在HeLa细胞、HEK293T细胞和AXIN1缺失的HEK293T细胞中过表达了这些突变体。与AXIN1 WT形成直径达1mm的点状突起相比，AXIN1 p.Arg723*表现为弥散的胞浆定位，AXIN1 p.Val799Glyfs*4和p.Arg805*均形成较小的、非球形的点状突起，说明C末端截短的AXIN1不能正确组装(图4)。

图4.C末端截短的AXIN1不能正确组装

为了确定AXIN1剪接变异体在生理水平上的后果，研究人员在HEK293T细胞中利用CRISPR/Cas9在第8外显子通过同源定向修复引入变异体c.2167C>T(p.Arg723*)，并在10号外显子通过引入移码突变模拟了变异体c.2395dupG (p.Val799Glyfs*4)和c.2413C>T (P.Arg805*)，并使用AXIN1特异性抗体对分离出来的克隆进行免疫沉淀，与AXIN1 WT对照相比，截短的AXIN1变体的蛋白质丰度降低。随后又通过β-catenin依赖的荧光素酶实验确定这些变异体表现出了Wnt通路的基础激活，且在一些克隆中Wnt靶基因AXIN2的表达明显增加。

通过实时定量PCR，研究人员观察到与原始HEK293T细胞系和AXIN1 WT克隆相比，所有AXIN1突变的HEK293T克隆的AXIN1 mRNA水平总体下降，表明C端截短的AXIN1变异体受到部分无义介导的降解。

在HEK293T AXIN1 WT和AXIN1 KO细胞中过表达时，AXIN1截短突变体仍然能够抑制Wnt通路，表明提高这些突变体的浓度可能提供一种恢复抑制活性的策略。由此，研究人员尝试通过阻断调节AXIN1和AXIN2蛋白酶体分解的多聚ADP核糖化酶端锚聚合酶1和2的酶活性来处理AXIN1突变克隆来验证这一假设，发现经过100nM-1mM XAV939(锚聚合酶抑制剂)处理过的克隆体的Wnt通路激活受到了剂量依赖性抑制(图5)。

结论

总之，该研究发现了一种由于AXIN1中的纯合截短变异导致其C末端DIX结构域缺失而导致的髋关节发育不良的硬化性骨疾病。对携带变体的原代细胞和基因编辑细胞的分析显示经典Wnt通路活性增强，而锚聚合酶抑制剂减弱了这种活性。

参考文献：Terhal P, Venhuizen AJ, Lessel D, et al. AXIN1 bi-allelic variants disrupting the C-terminal DIX domain cause craniometadiaphyseal osteosclerosis with hip dysplasia. Am J Hum Genet. 2023;110(9):1470-1481.

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撰文：孙廿一

编辑：刘振兴

审核：张贤钦

课题组网址 http://life.hust.edu.cn/info/1046/13645.htm

课题组介绍-分子医学团队