A high-throughput screen to identify novel small molecule inhibitors of the Werner Syndrome Helicase-Nuclease (WRN)

高通量筛选鉴别新型沃纳综合征小分子抑制剂螺旋酶核酸酶（WRN）

沃纳综合征（WS）是一种常染色体隐性遗传疾病，表现出加速的临床衰老症状，导致平均寿命低于50岁。WS螺旋酶核酸酶（WRN）参与了许多重要的途径，包括DNA复制、重组和修复。复制细胞依赖于解旋酶的活性，从而将人类解旋酶作为癌症治疗的潜在治疗靶点。DNA解旋酶的小分子抑制剂可用于诱导合成杀伤性，其试图靶向肿瘤细胞中的解旋酶依赖性补偿DNA修复途径，这些肿瘤细胞在特定的DNA修复途径中已经遗传缺陷。另外，螺旋酶抑制剂可作为研究螺旋酶在复制和DNA修复中的特殊作用的工具。在这项研究中，大约350000个小分子被筛选基于他们的能力，以抑制双链DNA解缠的催化活性WRN螺旋酶域片段在高通量荧光分析，以发现新的非共价的WRN螺旋酶小分子抑制剂。筛选筛选出的化合物不包括那些通过筛选中的其他螺旋酶抑制DNA解离、与DNA非特异性结合、作为不可逆抑制剂或具有不良化学性质的化合物。测试了几种化合物对培养的肿瘤细胞增殖的影响。我们观察到两种新鉴定的WRN螺旋酶抑制剂以家族依赖性方式抑制癌细胞的增殖。这些研究是WRN螺旋酶抑制剂的第一个高通量筛选，其结果对针对不同癌细胞和遗传背景的WRN的抗癌策略具有指导意义。

WRN基因产物的分子和细胞功能在遗传性加速老化疾病WS中有缺陷，这一特征在研究中有着重要的意义。WRN编码一种具有双重催化活性的蛋白质，一个3_到5_DNA螺旋酶和一个3_到5_DNA外切酶。大量研究已经检查了WRN DNA底物的特异性及其与蛋白质的相互作用。表明WRN是一种多任务酶，在细胞核酸代谢途径中具有多效性，包括复制、DNA修复、重组和转录。

在目前的研究中，我们开始建立一个高通量的WRN螺旋酶活性测定，避免使用放射性来大大增加在初始生化筛选中可以测试的化合物的潜在数量。与迄今为止为鉴定WRN螺旋酶抑制剂而进行的更传统和更小规模的筛选相比，这种大规模体外策略的开发可能是有利的。我们描述了开发筛选的实验方法，以及对WRN催化的DNA放卷有抑制作用的几种新化合物的表征。其中两种新发现的抑制WRN螺旋酶活性的化合物以依赖p53和端粒酶状态的方式抑制细胞增殖。这些结果为识别和鉴定WRN螺旋酶抑制剂提供了一条新的探索途径，这将有助于社区致力于为基础科学和可能的治疗方法确定核酸代谢途径。

结果

低容量荧光螺旋酶测定法的研制，为了开发一种用于评估螺旋酶活性的高通量荧光分析方法，我们需要从确定低容量分析中最佳荧光团、反应条件和试剂浓度开始。基于对BLM螺旋酶的类似研究，以及我们用于通过WRN和其他螺旋酶测量DNA退绕的DNA底物，我们采用20 bp分叉DNA双链，30个核苷酸尾，在双链区末端具有TAMRA and Black Hole Quencher 2 (BHQ2)部分（图1a），以测量WRN螺旋酶活性。我们还需要一种生产具有催化活性的重组WRN螺旋酶蛋白的方法，这种酶蛋白可以放大到100毫克，用于高通量筛选。为此，我们利用先前研究中的细菌表达质粒，纯化了一个功能性GST标记的WRN螺旋酶域（氨基酸500–946，图1b），与全长WRN蛋白相比，其小到能够在更高浓度下产生。

图1。荧光螺旋酶分析进展。

（a）描述荧光标记的叉状DNA底物，用于高通量螺旋酶分析（FOKF）。（b）考马斯染色凝胶显示纯化的GST-WRN500—946。箭头表示代表GST-WRN500-946片段的带及其大小（kd）。（c）用gst-wrn500-946（0–96 nm）在96孔黑板中开始与ATP（2 nm最终浓度）和forkf DNA底物反应0–60 min后展开荧光叉状DNA底物叉（200 nm）的图。从每个蛋白质浓度的所有时间点中减去t=0 min时记录的背景荧光。

在GST-WRN500-946（0–96 nm）中加入FOKF（200 nm最终浓度）和ATP（2 mm最终浓度）后，在几个时间点采集荧光读数，这些荧光读数在室温下预培养15分钟，以模拟与小分子的结合。根据测试的每个GST-WRN500-946浓度的时间绘制背景减影荧光图（图1c）。我们可以检测到每种浓度的GST-WRN500-946在所有时间点的荧光增强，当与没有酶的DNA底物相比。这一概念验证使我们能够使用更类似于高通量屏幕的仪器进行初始测试。在这些分析中，进行动力学分析，以确定运行反应的最短时间，其中，由于GST-WRN500-946  20 nm）的荧光叉DNA底物（100 nm）的展开，可在缺乏酶的反应获得的背景信号上方检测到统计显著的荧光量（图2a）。确定5分钟的反应时间足够，Z_系数为0.78（图2a）。WRN螺旋酶片段也在4°C下进行了长达20小时的稳定性测试，测量并比较其在4°C下放置后1、4和20小时的活性（图2b）：证明的稳定性支持计划的大规模自动筛选活动。在前期工作的基础上，为运行高通量分析设定了反应条件（图2c）。为了确保我们能够在屏幕上检测到GST-WRN500-946螺旋酶活性的抑制，我们建立了一个相对较小的LOPAC1280库的试运行。

图2。荧光法高通量螺旋酶测定试验。

（a）20纳米大肠杆菌纯化GST-WRN500-946的反应开始后0-10分钟内的叉状DNA底物（100纳米）解绕图，以及显示时间点t=0和t=5分钟之间荧光变化的条形图，以及在材料和方法中描述的计算出的相应z'因子。（-）enz和（+）enz是指在反应中没有或存在GST-WRN片段。反应在1536孔的黑板上进行。（b）试剂在4°C下储存1、4或20小时后，在存在2 mM ATP的情况下，在分叉DNA底物（100 nm）上测量GST-WRN500-946螺旋酶活性（条，荧光单位变化）。为每个存储时间点（带闭合圆的直线）计算z’-因子。（-）enz和（+）enz是指在反应中没有或存在GST-WRN片段。反应在1536孔的黑板上进行。（c）高通量GST-WRN500-946螺旋酶分析反应条件和步骤由分析开发确定。

用于测定优化和可扩展性的WRN抑制剂的lopac1280文库筛选。研究的下一阶段是利用lopac1280图书馆。该库由1280种药理相关药物和其他具有已知生物活性的结构组成，为优化和验证高通量分析提供了许多潜在的化合物。建立了5个不同的1536孔板，每个孔板含有材料和方法部分中所述的所有1280种化合物的不同浓度（80-50μm），代表剂量响应曲线，也被称为定量高通量筛选（QHTS）。抑制叉状DNA底物（100 nm）上GST-WRN500-946螺旋酶（20 nm）活性的化合物由每个板上的点指示（矩形，图3a）。从每个平板获得的结果产生了0.7到1之间的Z_系数（图3b），表明整个试验屏幕的分析强度良好。来自Lopac筛选文库的几种化合物在抑制WRN解旋酶活性方面是有效的。示出两种不同的抑制曲线的四种化合物作为例子（图3C-3F）。

图3。筛选WRN抑制剂的lopac1280文库。

（a）含有lopac1280筛化合物的1536孔板的活度热图表示，每个板矩形对应于不同浓度（80 nm、400 nm、2μm、10μm和50μm）的化合物。单个点表示在该特定浓度下化合物抑制GST-WRN500-946（20 nm）对分叉DNA底物（100 nm）的解绕。（b）LOPAC1280屏幕中每个板（浓度）的Z-系数。（c-f）图显示不同分子和这些分子的结构抑制了GST-WRN500-946（20纳米）螺旋酶在分叉DNA底物（100纳米）上的活性。浓度以对数单位表示。

为了进一步验证运行高通量筛选的可能性，使用GST-WRN500-946螺旋酶片段（20 nM）对来自LOPAC1280文库筛选的两种抑制化合物进行了测试，并用Forkr DNA底物（0.5 nM）进行了辐射螺旋酶分析，以验证它们作为抑制剂的状态，并确定是否存在抑制作用。荧光和辐射螺旋酶分析的曲线相似（图4a和4b）。从辐射测定获得的数据点覆盖了荧光数据产生的曲线（图4c和4d）。

图4。放射和高通量荧光螺旋酶测定的比较。

（a）显示通过增加NCGC00 185850-03的浓度来抑制放射性标记的Furkr DNA底物（0.5 nm）的GST-WRN500—946（20 nm）解体的凝胶图像。（b）凝胶图像显示通过增加NCGC000 015168—04的浓度，抑制放射性标记的Furkr DNA底物（0.5 nm）的GST-WRN500—946（20 nm）的展开。（c）用LopAC1280高通量分析法（填充正方形和线）从图4A（填充圆）中用凝胶图对NCGC900185850-03进行凝胶定量。NCGC00185850-03的结构包含在图形的开放空间中。（d）用LopAC1280高通量分析法（填充方格和线）从图FB 4B（填充圆）中覆盖凝胶，用NCGC0015168—04的图表进行定量。NCGC00015168-04的结构包含在图形的开放空间中。

小分子库荧光螺旋酶活性筛选鉴定WRN催化双链DNA解卷抑制剂，我们收集了大约35万种化合物用于筛选，这些化合物从多种来源组装而成，以提供具有已知纯度、特性和溶解性的多种化学支架。为了对这些化合物进行高通量筛选，我们需要产生大约50毫克的重组WRN螺旋酶片段。为了实现这一目的，我们将螺旋酶域片段克隆到几种质粒中，用于昆虫细胞或细菌表达，以优化表达和产量。我们选择了GST或MBP标记的昆虫细胞表达质粒（S1图中的图A），并纯化了该蛋白（S1图中的图B）。从昆虫细胞分离出的GST-WRN500-946片段在高通量筛选中使用，条件如图2c所示（20 nM GST-WRN500-946，100 nM ForkF DNA底物），结果总结见Pubchem。约35万种化合物中，0.5%的化合物对WRN螺旋酶结构域片段有抑制作用。1.7%的化合物是不确定的，剩下的97.8%是不活跃的（s2图）。为了验证活性化合物，在Pubchem（国家生物技术信息中心）上也发现了一个验证性的屏幕上重新测试了大约600个HIT分子。其中，只有不到400种化合物被确认为活性化合物。在与初始筛选相同的条件下进行两次筛选，以进一步缩小活性化合物的范围，以便进行额外的测试。首先是消除与DNA结合的化合物。虽然这些化合物可能抑制WRN螺旋酶的活性，但也可以预测它们也会非特异性地抑制其他DNA代谢酶。大约600种化合物中，有不到100种被检测出DNA结合阳性，没有进一步的特征。另一个反筛选取消了已知抑制BLM螺旋酶结构域片段的任何化合物。来自WRN高通量屏幕的点击与来自同一个库的BLM屏幕的点击交叉引用，并且作为候选物去除没有表现出至少十倍选择性的化合物。

从高通量筛选中选择WRN抑制剂的验证，择了一组32种化合物，它们代表了在一个或两个筛选中不确定或活性的化合物（初始筛选和确认筛选）。如材料和方法一节所述，用全长重组WRN蛋白（1nM）和Forkr DNA底物（0.5nM）在辐射螺旋酶分析中以50μm的单一浓度测试化合物。包含有代表性的凝胶图像（图5）示出了在11种化合物存在下的Furkr DNA底物的全长WRN展开：七的这些被抑制的叉状DNA底物的全长WRN蛋白解卷曲，而四种化合物被发现是不活跃的。

图5.确认高通量筛选化合物抑制全长WRN螺旋酶活性。

在高通量筛选中，在50μm浓度下，在11种化合物存在下，显示放射性标记的Furkr DNA底物（0.5 nm）的全长WRN（1 nm）的凝胶图像。车辆是DMSO。填充三角形是热变性DNA的控制。

下一步是评估选择的化合物以确定抑制的IC50值，以及这些化合物是否可逆地抑制全长WRN螺旋酶活性。根据筛选和放射分析中的抑制作用，以及排除具有不希望的化学特征的化合物，选择了18种化合物。对于每种化合物，我们用固定浓度的全长WRN蛋白（1nm）在大范围浓度下进行滴定，并且在没有化合物的情况下，以叉式DNA底物（0.5nm）全长WRN展开的百分比定量展开（图6a和6b，S3图）。每种化合物的IC50是通过测定化合物的浓度来计算的，该浓度导致DNA解卷减少50%。除了测定每种化合物的IC50值外，我们还进行了螺旋酶测定，以确定每种被测化合物抑制的可逆性。在浓度比其IC50值高10倍的情况下，用每种化合物短暂地培养100纳米WRN。添加DNA底物（0.5nM最终浓度）和ATP（2 mM最终浓度）将反应稀释100倍，并测量解卷（图7a-7d，S4图）。根据解旋酶活性在化合物100倍稀释后恢复的能力，可将抑制分为可逆、部分可逆、最低可逆或不可逆。

图6.放射螺旋酶法测定复合抑制全长WRN螺旋酶活性的IC50值。

（a）在增加的NCGC000 123016-02和NCGC0113055-02（0 - 100μm）的存在下，放射性标记的Furkr DNA底物（0.5 nm）的全长WRN（1 nm）解体的凝胶图像。（b）图6a的定量。存在载体（DMSO）时通过WRN展开设定为100%控制DNA展开。X轴以对数刻度显示。

图7。辐射螺旋酶法测定复合抑制全长WRN螺旋酶活性的可逆性。

（a）在MLS0260802802稀释100倍后，在Furkr DNA底物（0.5 nm）上的全长WRN（1 nm）退绕动力学（0～16分钟）的凝胶图像比该化合物的IC50低10倍。（b）在MLS000 116075-02 100倍稀释后，在Furkr DNA底物（0.5 nm）上的全长WRN（1 nm）退绕动力学（0～16分钟）的凝胶图像，比该化合物的IC50值低10倍。（c）从FIG 7a定量凝胶。填充圆表示在存在车辆（DMSO）和在MLS000 260802802存在下开环的WRN展开。（d）从FIG 7b定量凝胶。填充圆表示在存在车辆（DMSO）和存在MLS000 116075-02的开环的情况下WRN展开。

根据包括IC50、剂量反应曲线、可逆性、化学结构、对其他屏幕中目标的活性和过滤器等多个因素，如自动荧光和有问题的反应基团，化合物的数量减少到三个（NCGC00029283、NCGC00063279和MLS002251300，图8a），最终选择它们。以进一步描述。这些化合物经过重新合成或再纯化，以验证其IC50值以及可逆性，在更彻底的来源（MLS002251300资源化和纯化，并称为NCGC00357377-01，图8a）

图8。所选化合物抑制全长WRN螺旋酶活性的特异性。

（a）NCGC00029283-03、NCGC00063279-03和NCGC00357377-01（以前称为MLS002251300）的结构，每种化合物在WRN、BLM和FANCJ存在下的IC50值（μm）如下。（b）在浓度增加的NCGC0029 83-03、NCGC000 06327—03和NCGC3535737—01（0～200μm）的存在下，在放射性标记的Furkr DNA底物（1 nm）上的全长WRN（20 nm）核酸外切酶活性的凝胶图像。（c）从FIG 8B定量凝胶，其中代表在梯子中的任何反应产物的核酸外切酶活性和核酸外切酶的抑制是通过在没有蛋白质的泳道中看到的完整底物的存在来确定的。

WRN螺旋酶抑制剂的特异性，从樱桃采摘的组分中鉴定出三种化合物，测试它们对分叉DNA底物（1nm）上WRN核酸外切酶活性（20nm）的影响，以及通过全长BLM（0.1nm）和FANCJ（5nm）螺旋酶（与WRN属于同一超家族2）解卷DNA的影响，以评估它们对WRN催化的抑制WRN的特异性。分叉DNA底物的缠绕（0.5nm）。这三种化合物在同一浓度范围内均不能抑制WRN核酸外切酶活性，在同一浓度范围内，它们表现出对WRN螺旋酶活性的抑制作用（图8b和8c）。然而，它们确实显示了在200μm浓度下抑制核酸外切酶活性的一些能力。在这三种化合物中，NCGC0035777-01（重新合成的MLS002251300-02）显示了WRN螺旋酶抑制的IC50，比FANCJ观察到的IC50低6倍（图8a，S5图中的图b），但仅比BLM观察到的IC50低2.5倍（fiG 8a，图5中的图a）。在此之前，BLM螺旋酶抑制剂ML216在抑制WRN螺旋酶活性方面表现出交叉反应性，但在基于细胞的分析中表现出对BLM抑制的特异性[16]；因此，我们对NCGC00357377-01进行了进一步的基于细胞的分析。其他两种化合物（NCGC00029283-03和NCGC00063279-03）显示WRN螺旋酶抑制的最低IC50值与FANCJ和BLM相比；然而，与NCGC0035777-01相比，IC50值的差异更为温和，表明它们可能显示出更大的缺乏特异性。尽管如此，这两种化合物也在细胞分析中进行了进一步测试，以评估它们对增殖的影响。在对先前进行的筛选的PubChem数据的回顾中，NCGC00357377-01在其他DNA代谢酶的不同筛选中的点击数最少，而NCGC00029283-03和NCGC00063279-03在高通量筛选中显示了一些对聚合酶的活性，但在相同的筛选中没有对BLM螺旋酶片段的活性。

HELA细胞增殖试验筛选WRN螺旋酶抑制剂，为了评估体外WRN螺旋酶活性筛选（使用荧光和放射分析）鉴定的小分子在细胞基础分析中是否具有生物活性，我们首先检查了它们对人宫颈癌细胞系HELA 1.2.11增殖的影响。在初始实验中选择50μm浓度的选定小分子，以确定HELA 1.2.11细胞对潜在抑制剂是否敏感。HELA 1.2.11细胞暴露于化合物或载体（DMSO）中。为了计算细胞增殖率，采用DMSO处理的细胞作为基线比较。在所测试的三种化合物中，没有一种在3天的存活率测量过程中对hela 1.2.11细胞增殖有显著影响（图9a）。相反，50μm浓度的WRN螺旋酶抑制剂NSC 617145对治疗后立即检测到的HELA 1.2.11细胞增殖具有非常强的抑制作用（图9a）。

图9。WRN解旋酶抑制剂对癌细胞增殖的影响。

（a）用50μm ncgc00029283-03、ncgc00063279-03、ncg00357377-01和nsc 617145（阳性对照）或载体（DMSO）处理的hela 1.2.11细胞在第0天和第3天的增殖，用wst-1细胞增殖试剂测量。（b）从第0天到第3天，用ncgc00029283-03（0–100μm）增加剂量处理u2-os细胞的增殖。（c）从第0天到第3天，用NCGC00063279-03（0–100μm）增加剂量处理u2-os细胞的增殖。（d）从第0天到第3天，100μm NCGC00357377-01处理的u2-OS细胞增殖。

WRN螺旋酶抑制剂对U2-OS细胞增殖的影响，hela细胞的特征是野生型p53表达减少，以及由于人乳头瘤病毒（hpv）元素导致DNA损伤后p53水平不能增加[26]。这就提出了p53状态可能在小分子WRN螺旋酶抑制剂影响细胞增殖的能力中起作用的可能性。此外，HELA  1.2.11细胞具有相对较长的端粒特征，并使用端粒酶维持端粒长度[27，28]。由于WRN与端粒（alt）路径的替代延长有关[29]，依赖于alt路径的细胞可能对WRN抑制剂也更敏感。为了解决这一可能性，我们用这三种化合物治疗了u2-os骨肉瘤细胞（表达野生型p53并利用alt通路保持很长的端粒）。在这种情况下，我们观察到在初次接触NCGC00029283-03（100μm）两天后，u2-OS细胞增殖减少了50%。三天后也可检测到NCGC00029283-03（100μm）的作用（图9b）。暴露3天后，NCGC00063279-03（100μm）的u2-OS细胞增殖减少了40%（图9c）。NCGC00357377-01（100μm）对U2-OS细胞的增殖无影响（图9d）。

讨论

选择NCGC00029283、NCGC00063279和NCGC00357377检测细胞系的抑制特异性和生物活性。这些化合物的化学性质使它们成为很好的候选药物。这三种化合物都有八个或更少的氢键受体和供体，分子量仅超过300 g/mol，极性表面积小于110A2。这些化合物也有四个或更少的可旋转键。所有化合物均表现出对BLM或FANCJ螺旋酶活性的抑制作用，IC50小于等于10μm，因此在生化分析中均未发现WRN特异性抑制剂。NCGC00357377不降低u2-os或hela细胞系的增殖，而其他两种化合物仅降低u2-os细胞的增殖。这两种化合物不能减少hela细胞中的细胞增殖可能是由于以下几个原因：1）缺乏能够阻止这些细胞凋亡的功能性p53，2）端粒酶而不是u2-os细胞中使用的alt通路维持端粒，或3）其他未知的细胞类型差异。与本研究中确定的其他两种WRN螺旋酶抑制剂相比，NCGC00357377在生物学上是不活跃的。

在单独的高通量筛选中，NCGC00029283和NCGC00063279均抑制造血蛋白酪氨酸磷酸酶（heptp），但均未被选作进一步开发的heptp抑制剂。然而，它们都是基于同一屏幕描述白血病和骨髓增生异常综合征治疗方法的专利的组成部分（美国专利申请号20120095032）。这是值得注意的，因为来自NCI60肿瘤细胞系小组的白血病细胞系对先前发表的WRN抑制剂（NSC 617145和NSC 19630）的药物敏感性高于平均水平。研究发现，WRN在慢性髓系白血病中上调，通过另一种非同源末端连接途径提高细胞存活率。最近的研究发现，NSC 617145和NSC 19630可以促进HTLV-1转化成人T细胞白血病细胞的凋亡。此外，一个研究人群中约10%的WS患者被发现患有血液学或淋巴肿瘤，如急性髓细胞白血病、T细胞白血病或白血病前骨髓疾病。所有这些证据都表明白血病对调节WRN螺旋酶活性的化合物敏感。

这些数据代表了大量已完成的工作，包括可扩展纯化蛋白的开发、分析开发、分析验证、筛选、反筛选、HIT验证、30种化合物的详细分析以及所选化合物的基于细胞的分析。在全长WRN蛋白（具有更多的潜在结合位点）上测试文库，尽管非常具有挑战性，但可能产生更多在螺旋酶片段筛选中未发现的抑制剂。虽然发现了几种具有不同IC50值和可逆性的化合物，但最终根据其化学和其他考虑因素选择了三种化合物。其中两种被测试的化合物表现出适度的生物活性；此外，这些化合物可逆地抑制WRN解旋酶活性的能力使其可用于需要暂时抑制WRN解旋酶活性的分析。本文所述的WRN催化功能在药理学上被调节，以及对WRN螺旋酶抑制最敏感的特定遗传突变背景的特征，以及化学诱导的与其他药物的合成杀伤力。