Determining the effects of DNA sequence on Hel308 helicase translocation along single-stranded DNA using nanopore tweezers 

用纳米孔镊子测定DNA序列对单链HEL308螺旋酶易位的影响

处理核酸底物的运动酶在基因组复制、表达和修复的各个方面起着至关重要的作用。已知DNA和RNA碱基以生物学意义上的方式影响这些系统的动力学。有研究表明，DNA碱基控制着单链DNA上螺旋酶的易位速度，但其原因尚不清楚。我们使用单分子比色计分辨率纳米孔镊子（SPRNT）来测量冈玛热球菌螺旋酶hel308沿单链DNA的易位动力学。SPRNT能在毫秒时间尺度上以亚稳态分辨率测量酶步，同时测量酶在DNA底物上的绝对位置。先前的SPRNT实验揭示了HEL308 ATP水解循环中存在两种不同的底物，一种是依赖于[ATP]的，另一种是不依赖于[ATP]。在这里，我们深入分析了[ATP]独立步骤的表观序列依赖行为。发现在HEL308的两个位点上的DNA碱基控制着[ATP]独立步骤的序列特异性动力学。提出了观察到的序列特异性易位动力学的机制。类似的SPRNT测量和方法可应用于其他核酸加工运动酶。

核酸加工运动酶，如螺旋酶、聚合酶和沿DNA或RNA移动的易位酶，在基因组复制、表达和维持中起着至关重要的作用。核酸(NA)序列已被证明可以调节某些酶的重要特性。例如，RNA聚合酶转录延伸和停顿由特定的DNA序列控制。由于AT和GC碱基对之间的能量差异，已知螺旋酶具有序列依赖性DNA解缠动力学。最近的研究表明，DNA螺旋酶hel308和uvrd在单链DNA（ssdna）上以序列依赖的方式易位，但这种序列依赖的机制尚不清楚。

为了了解DNA序列在螺旋酶hel308对ssdna序列依赖易位中的作用，我们使用了单分子比色计分辨率纳米孔镊子，是一种既具有高时空分辨率又能直接揭示通过运动酶的na序列的高通量技术。在这里，我们使用SPRNT来确定HEL308中动力学参数和DNA序列之间的关系。在SPRNT中，磷脂双层中的单个分枝杆菌smegmatis porin a（mspa）纳米孔（17）在两种电解质溶液之间形成唯一的电连接（图1a）。施加在纳米孔上的电压使离子流过纳米孔，从而形成可测量的离子电流。与运动酶结合的带负电荷的钠被电场吸引到纳米孔中，直到酶停在纳米孔的边缘。这种酶沿着钠移动，使钠穿过纳米孔。纳米孔中的Na碱基根据纳米孔中的核苷酸序列降低流经纳米孔的离子电流，从而实现纳米孔测序。离子电流还提供了沿着NA的酶位置的精确时间记录（图1b）。在SPRNT过程中，DNA上的电力会对酶产生一个力（~0.2 pn/mv，在180 mv电压下产生~35 pn的力），该力可以与酶的运动或对抗酶的运动（15）。虽然该力可能影响螺旋酶动力学，但我们观察到，hel308与施加电压在～30–65 pn（13）范围内无关。SPRNT是唯一一种同时读取NA序列并提供对NA上酶运动的高分辨率测量的单分子技术（<1在1 ms状态持续时间（15,16）），使该技术成为了解NA序列如何影响运动酶动力学的理想方法。

(a)通过电极施加的电压（灰色），将一个与HEL308螺旋酶（蓝色）结合的单个DNA分子（黑色）吸入MSPA孔（黄色）。离子电流被测量并用于监测沿着DNA链的hel308螺旋酶的进展。x表示螺旋酶中纳米孔收缩与序列依赖效应位点之间的距离。（b）单个HEL308分子的位置与时间轨迹，指示向后的步骤。MSPA纳米孔中的DNA序列与相关的DNA位置有关。该曲线由当前与时间数据通过非线性转换函数构造。（c）DNA设计。当HEL308沿着一个21 nt DNA测试序列（红色）行走时，我们改变了HEL308的动力学，异性聚合物测量序列（蓝色）通过MSPA收缩，产生一系列高对比度的离子电流状态，在此状态下进行动力学测量。n是A、C、G和T中的任何一个。此序列中的x指的是一个碱基位置，不应混淆面板A中的距离测量。

我们以前使用sprnt来描述温cocus gammatolerans超家族2 DNA螺旋酶hel308的ATP酶循环如何协调单链DNA（ssdna）底物（13）上的易位。HEL308是一种在古细菌和真核生物中发现的3′到5′转位酶/螺旋酶，被认为与重启停滞的复制机制有关。我们发现，HEL308通过MSPA纳米孔在每个转移的核苷酸中分两步提取DNA。我们假设这些DNA的亚NT运动是HEL308构象变化的结果。其中一个步骤的动力学与[ATP]有关，而另一个步骤的动力学与[ATP]无关。因此，这两个步骤代表了HEL308水解循环的两个独立阶段，其中[ATP]依赖性步骤与ATP和ADP结合有关，而[ATP]依赖性步骤与ATP水解有关。状态停留时间，以及HEL308后退的倾向，在[atp]依赖和[atp]独立状态下沿着异源DNA底物发生了很大的变化，我们假设这是由于特定于HEL308（13）的DNA相互作用基。在这里，我们通过检查不同DNA序列的26个不同的短ssdna底物上的1256个单分子sprnt记录（补充表S1），研究了DNA序列对hel308螺旋酶转移ssdna的影响。

结果

同聚物序列和二核苷酸重复序列上的hel308易位,我们首先分析了21个核苷酸长的腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）的同聚体序列的hel308易位，由于二级结构的形成，我们没有测试均聚鸟嘌呤（G），但我们检查了下面的一个富G链。我们发现[ATP]独立步骤的平均停留时间在每个均聚物的许多核苷酸上近似恒定，但在三个序列中的每个序列（Ta=70±2 ms，Tc=55±3 ms和Tt=44±1 ms，图2a）之间有所不同。然而，在～20nt（位置20-25，图2a）之后，三个序列中的每一个的停留时间显示出一个共同的模式，表明hel308已经退出“测试序列”，并开始沿着我们在本实验中使用的每一条DNA链共同的“测量序列”行走。

（A）在腺嘌呤（左），胞嘧啶（中）和胸腺嘧啶（右）的均聚物序列上Hel308易位的前向步骤与DNA位置的平均停留时间。在每个图中绘制的浅蓝色线是在DNA位置0-16上取得的平均值。阴影框表示每个序列之间具有相同动力学的DNA位置，表明Hel308在与本研究中使用的每个DNA序列相同的“测量序列”上易位。 （B）在腺嘌呤（左），胞嘧啶（中）和胸腺嘧啶（右）的均聚物序列上Hel308易位的向后步骤与DNA位置的概率。在每个图中绘制的浅蓝色线是在DNA位置0-16上取得的平均值。 （C）在GT（最左侧），AG（中间左侧），CA（中间右侧）和TC（最右侧）的二核苷酸重复上，Hel308易位的前向步骤与DNA位置的平均停留时间。 （D）在GT（最左侧），AG（中间左侧），CA（中间右侧）和TC（最右侧）的二核苷酸重复上，Hel308易位的向后步骤与DNA位置的概率。这些图中的每一个都是按时间排序的，因此3'位于左侧，5'位于右侧。间隙是DNA位置，其中离子电流状态类似于相邻状态。这些间隙在均聚物（图A和B）和二核苷酸实验（图C和D）之间略有不同，因为实验使用略微不同的测量序列（补充讨论，补充图S5，补充表S1）。所有误差条都是SEM。

接下来，我们检查了HEL308易位在同聚物序列上的后退与DNA位置的概率（图1b）。我们发现腺嘌呤和胸腺嘧啶均聚物后退的概率分别为15±1%和19±1%，然而，HEL308很少后退到胞嘧啶均聚物上（2.4±0.7%）。同样，在～20nt之后，三个序列中的每一个向后步的概率都相似。因为停留时间和后退的可能性只取决于酶内的序列，而不取决于MSPA纳米孔收缩中的核苷酸类型。

还对所有可能不会形成发夹结构的二核苷酸重复序列平均停留时间和DNA位置。如预期的那样，停留时间与2-nt周期性交替，与序列依赖效应一致。同样，在～20nt之后，每个序列的停留时间显示出与图1a所示的均聚物测试序列相同的模式。图2d显示了四个二核苷酸测试序列中每一个的反向步骤与DNA位置的概率。后退概率也与2-nt周期性交替。在四个二核苷酸测试序列中的三个中，停留时间与向后步骤的概率（gt、ca和tc）相关，而在另一个序列（ag）中，停留时间与向后步骤的概率反相关，这可能意味着依赖于hel308中DNA序列的hel308向后步骤的不同机制。这两个含有胞嘧啶的序列显示，hel308很少在其他核苷酸位置出现反足。在含有腺嘌呤的两个二核苷酸序列中，我们发现在其他核苷酸位置后退的概率大于在同聚腺嘌呤序列中观察到的概率（Ca为29±2%，Ag为57±2%）。这表明在HEL308中不止一个核苷酸参与了所观察到的动力学，而且腺嘌呤促进了反步态。

DNA序列替换法测定MSPA纳米孔收缩与HEL308的配准

为了确定配准距离x，我们测量了一个异质聚合物测试序列上的hel308易位（图3a，黑色）。我们观察到，在这个DNA序列的9位，HEL308的后腿>50%的时间。基于我们上述的结果，我们认为靠近胞嘧啶和鸟嘌呤的腺嘌呤促进了hel308反步（图2），我们确定序列3′…agac…5′可能是导致大概率后退的候选序列。为了验证这一DNA序列对观察到的动力学起作用，使用胞嘧啶似乎减少了反步法，并将DNA序列AGAC顺序改为ACAC、ACCC和CCCC。图3显示了这四个序列中每一个的反向步进相对于DNA位置的概率。我们发现，与MSPA纳米孔收缩中测得的序列相比，通过X=20nt抵消DNA序列，HEL308显著减少了每个引入的胞嘧啶位置的反塞进（图3中的位置7、8、9），而其他位置的反塞进大多不变。事实上，当注册设置为20nt时，在x=20nt的胞嘧啶下，每个DNA位置后退一步的概率小于5%，而当其他核苷酸距离MSPA纳米孔收缩20nt时，后退一步的概率更大。停留时间也在与后退动力学相同的DNA位置变化（补充图S6-S7，支持讨论）。这些结果表明，MSPA纳米孔收缩与主要负责HEL308内序列相关动力学的核苷酸之间的登记距离为x=20nt。

异种聚合物试验序列序列序列突变的反向步进与DNA位置的概率。三个被怀疑在9号位置（顶部，黑色）引起大概率后退的碱基依次突变为胞嘧啶：（顶部）Agac到Acac（中间）Acac到Accc（底部）Accc到CCCC。与MSPA收缩中的核苷酸相比，DNA序列被抵消了20 nt，因此DNA序列的变化与观察到的后退概率中最显著的变化相匹配。与最初的“aga”序列相比，每种胞嘧啶的引入都会导致后退的可能性降低。每个图都是按时间顺序排列的，因此3'在左边，5'在右边。间隙是指离子电流状态与相邻状态相似的DNA位置。所有误差线均为扫描电镜。

富含鸟嘌呤的序列分析，为了了解鸟嘌呤对hel308动力学的影响，我们分析了一个富含鸟嘌呤的序列上hel308的易位。发现在许多情况下，当鸟嘌呤距离MSPA纳米孔收缩20 nt时，后退的可能性很小。然而，距离MSPA收缩x=19 nt至x=21 nt的三个连续鸟嘌呤产生了很大的后退可能性（两个GGG基序为50%和70%，补充图S8），表明至少三个核苷酸影响序列依赖动力学。

受均聚物和二核苷酸实验（如在18和20位的二核苷酸Ag实验中的长停留时间状态）变化的激励，我们进行了一项实验，在该实验中，我们改变了围绕单个“ggg”基序的序列上下文，以确定其他核苷酸位置是否影响hel308动力学。图4显示了两个测试DNA序列（其中一个为3′…aaagggccc…5′形式，另一个为3′…ccgggaa…5′形式）的反向步进相对于DNA位置的概率。我们发现，当中心鸟嘌呤在x=20nt时，第一个测试序列后退的概率为36±3%，而第二个测试序列后退的概率为86±7%，这表明x=20nt周围的DNA序列环境也会影响迁移动力学

对于两个序列，一个是3′…aaagggcc…5′（红色）和一个是3′…ccgggaaa…5′（蓝色）的反向步进与DNA位置的概率。改变“ggg”基序周围的上下文会导致在中心鸟嘌呤位置向后一步的概率从36%变为86%，这表明额外的序列上下文也有助于观察到的反步行为。每个图都是按时间顺序排列的，因此3'在左边，5'在右边。间隙是指离子电流状态与相邻状态相似的DNA位置。所有误差线均为扫描电镜。

HEL308在杂聚物上的易位，为了确定HEL308中哪些附加位点负责序列依赖动力学（图5a），我们分析了10个21 nt长的杂聚物序列的HEL308易位（补充表S1）。图5b显示了在远离MSPA缩窄的Xth核苷酸识别的情况下，后退步与DNA位置的概率。例如，x=20nt处的蓝色数据点是后退的平均概率，假设腺嘌呤位于离MSPA收缩20nt处。根据上述实验，我们发现当腺嘌呤为x=20nt时，与平均值相比，后退的概率较大；当胞嘧啶为x=20nt时，与平均值相比，后退的概率显著降低。此外，该图显示，当胞嘧啶距离MSPA收缩17 nt时，后退的可能性也降低了，这与我们观察到的“ggg”基序5'侧的胞嘧啶导致后退的可能性降低一致（图4）。

（a）说明MSPA收缩中DNA碱基与HEL308螺旋酶中DNA碱基之间的登记（X）的示意图。（b）MSPA收缩（x）以上位置的倒退平均概率，前提是x位置的核苷酸为腺嘌呤（蓝色）、胞嘧啶（绿色）、鸟嘌呤（黄色）或胸腺嘧啶（红色）。黑线是所有数据的平均值。（c）平均停留时间与x，给出位置x处的核苷酸。黑线是所有数据的平均值。

图5C显示了HEL308的平均停留时间向前的步骤与DNA位置，再次条件是远离收缩的Xth核苷酸。我们发现，在x=20nt时，由于胞嘧啶，停留时间略有减少，但在x=17nt时，与平均值相比，停留时间有所增加。胸腺嘧啶在x=17nt时导致停留时间缩短，这与我们观察到的胸腺嘧啶均聚物上HEL308易位的停留时间比腺嘌呤或胞嘧啶短一致。

[ATP]依赖步骤分析，虽然我们主要关注[ATP]独立步骤，但我们也研究了[ATP]依赖步骤。如上所述，我们绘制了平均停留时间与DNA位置之间的关系，条件是远离MSPA纳米孔收缩的Xth核苷酸（补充图S9）。我们发现单个DNA的位置与停留时间之间没有明显的关系，但是使用同聚物和二核苷酸重复的停留时间分布的统计分析表明，DNA序列确实影响了依赖于[ATP]的步骤（支持讨论）。这表明，在依赖于[ATP]的步骤中，有几个DNA碱基负责序列依赖性行为。一项涉及更多序列背景的研究将有必要阐明[ATP]依赖性步骤中序列依赖动力学的原因。

讨论      

我们应用SPRNT研究了ssdna碱基组成对hel308螺旋酶易位动力学的影响。SPRNT在毫秒尺度上解析亚核苷酸长DNA运动并将动力学与酶内DNA组成关联的能力揭示了HEL308的详细的序列依赖性行为。这种序列依赖性活性的直接观察超出了其他单分子技术的能力。我们发现，HEL308螺旋酶中的序列依赖动力学主要由HEL308中两个位点的核苷酸决定，相对于纳米孔MSPA收缩，在x=17 nt和x=20 nt处。完全理解序列依赖性的机制需要详细研究DNA如何以及在何处与hel308中的氨基酸残基相互作用。

HEL308螺旋酶有五个主要结构域（23）：在SF1和SF2螺旋酶中存在的两个Reca折叠，通过一英寸蠕虫机制（3,24）产生定向运动，一个有翼螺旋结构域促进与双链DNA（25）的结合，一个棘齿结构域通过氢键和在多个位点的堆叠相互作用与DNA碱基相互作用。这是DNA和螺旋-环-螺旋结构域，它对退绕活性具有自动抑制作用（26）。与DNA结合的黄褐藻HEL308的晶体结构表明，HEL308与10个不同位点的DNA碱基直接相互作用（23）。与DNA碱基相互作用的残基在我们在本研究中使用的T.gammatolerans的hel308和A.fulgidus之间保存。图6描述了HEL308和模板DNA序列之间的接触。两个reca折叠和有翼螺旋结构域主要与DNA主干相互作用，而棘轮结构域4在几个不同的位置与碱基本身相互作用（由+3、+5、+6图6标记）。棘齿结构域中碱基特异性相互作用的存在为序列依赖性动力学提供了可能的解释，因为这些氨基酸和DNA之间的相互作用能可能被碱基含量改变。这些保守残基是潜在的突变位点，可用于确定哪些氨基酸残基影响序列依赖动力学。

图6。

描述了HEL308氨基酸残基和模板DNA之间的疑似接触，这是基于对冈玛热的HEL308和古生叶斑的HEL308晶体结构的比较（23）。HEL308氨基酸残基根据蛋白质结构域着色：reca结构域1（蓝色）、reca结构域2（绿色）、β-发夹基序（粉红色）、带翼螺旋结构域3（橙色）、棘轮结构域4（红色）。虚线为氢键相互作用，横条为叠层相互作用。左边显示的接触与磷酸糖骨架相互作用，而右边的接触与碱本身相互作用。DNA结构在-1和+1位点之间被β发夹扭曲，在+5和+6位点之间被棘轮域扭曲。DNA 3'端在顶部，5'端在底部。

对序列依赖性步进的另一种解释是螺旋酶内碱基的立体效应改变了Reca折叠到DNA底物的相对结合能。序列对hel308动力学的主要影响发生在x=17 nt和x=20 nt。这些位点之间的三个核苷酸分离与沿着DNA主干（23）的reca结构域接触的分离相当。在图6中，这可能对应于由+1和+4标记的核苷酸位置。这些是Reca结构域1中的基序IV螺旋和Reca结构域2中的基序IA螺旋与DNA接触的位置。在ATP诱导的HEL308构象变化过程中，这些螺旋的相对结合能被认为导致螺旋酶沿DNA的蠕动。螺旋酶核内碱基的空间效应可能影响这些相互作用，从而影响易位动力学。在未来的工作中，我们将突变与DNA接触的HEL308位置，以阐明序列特异性易位的机制。然后我们可以为hel308突变体库构建类似于图5所示的曲线，并确定在x=17 nt和x=20 nt时哪些突变导致动力学变化。

注意到hel308和uvrd（14）观察到的序列依赖性易位动力学，DNA的异质性，以及sf1和sf2螺旋酶与DNA之间的大量接触（23,27），似乎许多NA运动酶都有序列依赖性动力学。螺旋酶中的这些作用是由于螺旋酶和DNA碱基之间的直接相互作用还是通过其他机制，仍有待确定。此外，这种序列依赖性在螺旋酶中的生物学作用还不清楚。为了充分理解运动酶动力学，必须充分理解和量化这种序列特异性效应。我们已经证明了SPRNT是一种理想的技术，可以用来确定钠序列对酶的动力学参数的影响。SPRNT可以以类似的方式应用于许多运动酶系统，从而为NA序列调节酶行为的机制提供光照。