长链非编码RNA(Long noncoding RNA)是一类长度大于200 nt，不编码蛋白质的RNA。LncRNA的功能多样，如图1所示，A：充当蛋白质和染色质的连接因子，引起染色质重构（chromatin remodeling）；B：充当miRNA海绵；C：充当“scaffold”脚手架；D：与转录因子结合，引起转录激活；E：把转录因子拉走，引起转录抑制；FGH：与mRNA结合抑制翻译、调节剪切，及降解mRNA等。

 图1. lncRNA功能 

由于lncRNA发现较晚，功能研究不完善，因此，我们可以以mRNA为桥梁对lncRNA的功能进行推断和研究。通常将lncRNA的功能分成cis和trans两种（图2）。Cis作用的原理是lncRNA的功能与其临近mRNA相关，可以以lncRNA基因组坐标上下游100 kb的mRNA作为lncRNA的靶基因进行研究。而trans作用的原理是lncRNA与其共表达的mRNA相关，可以根据表达量计算相关性以预测lncRNA的靶基因（一般要求样品数超过6个），从而研究lncRNA的功能。

图2. Cis vs trans

相关系数（correlation coefficient）

相关系数用来衡量两个变量X和Y间的相关性。相关性包括：线性相关和非线性相关。

Pearson相关系数用来衡量两个变量X和Y之间的线性相关关系。常用r表示，取值范围为[-1,1]。其中负的表示负相关，正的表示正相关。值越大相关性越强。

而spearman秩相关系数用来衡量两个变量间的非线性相关关系。是一个非参数度量。常用rho（ρ）来表示。取值范围也是[-1,1]。

常见的相关性标准为：不相关：0-0.1 ；低相关：0.1-0.3；中等相关：0.3-0.5；显著相关0.5-1.0。应参考具体使用场景进行判断。

虽然pearson相关系数最常用，然而它受数据分布的影响，对异常值敏感，需要数据服从近似正态分布才能使用。然而，我们遇到的数据是非常复杂的，往往并不符合线性相关，因此，越来越多的研究者使用spearman秩相关系数（Spearman’s rank correlation coefficient）计算两个变量间的相关性。注意：相关性不隐含因果关系。

在lncRNA-mRNA共表达相关系数计算中，pearson相关系数和spearman相关系数都有使用。例如在《Genome-wide analysis of lncRNAs, miRNAs, and mRNAs forming a prognostic scoring system in esophageal squamous cell carcinoma》文章中，作者写道“The correlation between prognostic lncRNA and mRNA expression profiles was analyzed by Spearman method, and the lncRNA-mRNAs pairs that the absolute value of correlation coefficients > =0.4 and p < 0.05 were selected to construct the co-expression network”，使用的是Spearman相关系数，rho阈值0.4，pvalue阈值0.05。而在《Genome-wide analysis of differentially expressed lncRNAs and mRNAs in primary gonadotrophin adenomas by RNA-seq》文章中，作者写道“The network is based on Pearson correlation coefficient (the absolute value of PCC ≥ 0.80, p-value < 0.001)”，使用的是pearson相关系数，r阈值0.8，pvalue阈值0.001。 

今天，我们来计算相关系数，并使用cytoscape软件绘制网络图。

1， 打开相关系数计算页面

首先，使用浏览器（推荐chrome或者edge）打开lncRNA-mRNA pearson、spearman相关系数计算页面。左侧为常见作图导航，中间为数据输入框和可选参数，右侧为描述和结果示例。

http://www.bioinformatics.com.cn/basic_lncrna_mrna_pearson_spearman_coexpression_analysis_t013

                                                                                                        图3.相关系数计算页面

2，示例数据

点击右侧“示例数据”链接下载excel格式的示例数据。

示例数据（仅供参考）分两部分，上半部分是lncRNA表达量，下半部分是mRNA表达量。其中行是基因，列是样品名。LncRNA和mRNA的样品名顺序必需保持一致。

                                 图4.输入数据

注意：需要参考示例数据，在excel中将自己的数据整理成示例数据的样式，每个cell都需要有数据，不能有空的单元格。

3，粘贴示例数据

拷贝示例数据中上半部分的lncRNA数据，粘贴到第一个输入框。拷贝示例数据中下半部分的mRNA数据，粘贴到第二个输入框。

图5. 将数据粘贴到输入框

注意：不是拷贝excel文件，是拷贝excel文件里边的数据。另外粘贴到输入框后，格式乱了没关系，只要在excel中是整齐的就行。并且数据矩阵中不能有空的单元格，中文字符等。

4，修改参数，并提交

我们设置了数据是否转化、相关系数算法等参数。由于示例数据来自芯片，因此这里不转化。使用pearson相关系数进行计算。

图6. 可选参数

5，提交分析

粘贴好输入数据，调整好参数后，点击提交按钮，3秒钟后，会在页面右侧出现结果。

图7.结果说明及下载

结果以excel存储。

图8. 相关系数结果

各列说明：

LncRNA：lncRNA名字

mRNA：mRNA名字

r：pearson相关系数

pvalue：p值

flag：+：正相关，-：负相关

6. 过滤结果

下载结果后，使用excel的筛选功能进行过滤，这里以p<0.05，|r|>=0.4的lncRNA-mRNA对绘制共表达网络（带header共28行）。

图9. 相关系数过滤

图10. P值过滤

7，导入cytoscape

拷贝这28行数据，粘贴到一个txt文件中。然后打开cytoscape软件，导入这个txt文件。在弹出的窗口中选择source和target。

                                    图11.导入txt

图12. 选择source和target，其中lncRNA为source，mRNA为target

                                  图13. 默认网络图

8. 网络图美化

经过对颜色，节点形状，线型，布局等的简单美化后，获得最终的lncRNA-mRNA共表达网络图（图12）。由于每个人的审美不同，因此这里需要花费大量的时间进行美化，有些研究者还会使用AI等软件给网络图添加背景色等进行进一步优化。

图14. 简单美化后的网络图

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