冷等离子体和氢气联合用于再生医学

摘要

在再生医学中，间充质干细胞（MSCs）已在组织重建和免疫系统调节方面展现出其重要性及潜力。然而，此类细胞的潜力常因氧化应激、免疫排斥以及植入不足等因素而减弱。本综述着重强调了氢气（H₂）和冷大气等离子体（CAP）作为辅助疗法在提高间充质干细胞疗法有效性方面的作用。氢气具有强大的抗氧化和抗炎作用，因其能清除活性氧物质，并积极刺激促进间充质干细胞存活及生命周期的Nrf2通路。冷大气等离子体作为活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的调控源，也通过改变细胞氧化还原平衡来助力间充质干细胞，进而促进细胞的适应、迁移及分化。氢气和冷大气等离子体相互配合有助于营造利于提升间充质干细胞存活及生长能力的环境，并在诸如伤口愈合、神经保护和局部缺血等多种途径中缩短愈合时间。除了这些方面，本综述还涵盖了在治疗中氢气、冷大气等离子体与间充质干细胞联用的最佳给药途径及剂量。本研究介绍了一种旨在改善间充质干细胞疗法疗效的新型双重方法，同时增添了与这些疗法相关的若干分子靶点及临床应用。未来的研究需致力于完善这些方案，以便在临床应用中最大限度地发挥治疗益处且避免长期不良影响。

本文是美国和俄罗斯学者合作2024年12月发表在《抗氧化剂》杂志上的最新综述文章。

Artamonov, M.Y.; Pyatakovich, F.A.; Minenko, I.A. Synergistic Antioxidant Effects of Molecular Hydrogen and Cold Atmospheric Plasma in Enhancing Mesenchymal Stem Cell Therapy. Antioxidants 2024, 13, 1584.

1. 引言

间充质基质细胞（MSCs）因其免疫调节和再生特性可用于治疗多种疾病。然而，诸多难题阻碍了其临床应用及疗效。间充质干细胞治疗在临床试验中很少能达到主要疗效标准，因为其在人体中的效果不如临床前研究显著。这主要归因于基于细胞疗法的转化变异性。各试验中缺乏统一的间充质干细胞认定标准导致了治疗差异。由于这种不一致性，基于间充质干细胞的疗法难以标准化及复制[1]。

异体间充质干细胞可能会因免疫排斥而失去其益处。衰老可能会降低老年人自体间充质干细胞的治疗功效[2]。将间充质干细胞递送至特定组织并使其靶向作用于该组织仍然困难。细胞表面黏附受体的缺失往往会降低间充质干细胞的植入效率及治疗功效[3]。间充质干细胞疗法可能会受到体外及体内微环境的影响。这些因素会影响间充质干细胞的迁移、活力及功能[4]。间充质干细胞（MSCs）可能引发并促进肿瘤发展，这使得其治疗应用存在风险[5]，如图1所示。

图1. MSC治疗的挑战和使用H2和CAP的潜在解决方案。这些挑战包括低生存率、免疫原性、致瘤性、氧化应激和炎症性。然后是h2溶液，它们提高了细胞存活率，抗氧化保护，并减少了细胞突变。同样，CAP治疗也包括免疫调节。

氧化应激——活性氧产生与抗氧化防御之间的失衡——会影响干细胞的存活、分化及功能。本综述综合多项研究来分析氧化应激如何影响干细胞。活性氧水平升高会抑制间充质干细胞增殖、促进衰老、降低成骨分化并增加脂肪分化[6]。氧化应激对细胞大分子造成的损伤会导致干细胞衰老和凋亡[7]。氧化应激会抑制干细胞的自我更新，并促进人类胚胎干细胞向神经谱系分化。丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶1/2（MAPK/ERK1/2）信号通路通过活性氧诱导的氧化应激促进自发性神经元分化[8]。低氧预处理（HPC）可维持氧化状态并降低活性氧水平，以保护间充质干细胞免受氧化应激影响。由于抗氧化防御增强及代谢变化，经低浓度过氧化氢预处理后的人类脂肪来源干细胞（hASCs）存活时间更长[8]。热休克蛋白90/核因子-κB（HSP90/NF-κB）信号通路对于氧化应激期间神经干细胞（NSC）的存活至关重要。调节热休克蛋白90可抵御氧化损伤。氧化应激通过细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）信号通路触发干细胞自噬，若不加以处理，自噬可能导致细胞死亡[9]。

抗氧化剂可中和自由基以减轻氧化应激相关疾病。新的抗氧化剂递送方法及技术已成为近期研究的焦点。基于细胞的测试，尤其是采用Caco - 2细胞的测试，在评估抗氧化活性及生物利用度方面正变得比体外和体内方法更为流行[10]。目前正在研究纳米颗粒、脂质体以及凝胶制剂以提高抗氧化剂的生物利用度及功效。这些技术克服了诸如膳食抗氧化剂溶解性和不稳定性等不足。含金属的催化抗氧化剂，包括锰基化合物，在清除多种活性氧物质方面已展现出良好前景。目前正在研究它们在治疗心血管疾病、神经退行性疾病以及炎症性疾病方面的潜力[11]。正在开发针对发生氧化还原失调的特定亚细胞区域（如线粒体和小窝）的新策略。这些策略包括基因和微小RNA（miRNA）疗法、纳米颗粒技术以及微肽靶向技术。利用可持续的天然单体合成抗氧化聚合物的技术正在不断改进。这些聚合物被用于食品包装、药物递送以及合成聚合物的生物降解[11]。来自药用植物的内生菌正被探索作为新型抗氧化剂的来源。这些微生物能产生具有抗氧化特性的独特代谢产物，为开发新型天然抗氧化药物提供了潜力。

本研究旨在探究氢气和冷大气等离子体对间充质干细胞（MSCs）的活力及治疗功效的影响。这涉及考察这些因素对细胞抗氧化反应、其生物学功能以及迁移至再生区域能力的影响。本研究旨在确定能使协同效应最大化以改善间充质干细胞疗法疗效的最佳条件，尤其在伤口愈合和组织再生方面。了解这些效应背后的机制或许可为开发针对多种疾病的更有效治疗方法提供思路，包括靶向刺激细胞凋亡的潜力。

本研究的空白点具体涉及详细阐释氢气和冷大气等离子体（CAP）如何协同增强间充质干细胞（MSCs）抗氧化效应的机制。本研究考察了氢气和冷大气等离子体联合处理对间充质干细胞的长期影响，重点关注潜在的细胞毒性和遗传稳定性，此外，还评估了抗氧化效应的长期可持续性。联合治疗的最佳剂量及给药方案旨在最大限度地提高治疗益处并尽量减少不良反应。

2. 氢气与冷大气等离子体：基本概念

氢气（H₂）和冷大气等离子体（CAP）是两种不同的实体，各具独特的化学和物理性质。冷大气等离子体是一种接近室温的电离气体，由中性粒子、带电粒子、活性物质以及电子组成。它可在环境空气中产生，并生成高能物质，包括电子、亚稳态粒子、活性氧物质（ROS）、活性氮物质（RNS）、紫外线辐射以及局部电场[12]。它无色、无味、无毒且极易燃烧。同样，冷大气等离子体能够与诸如自来水之类的液体相互作用，通过产生过氧化氢、氢氧根离子和硝酸根离子等活性物质来改变液体的化学成分。尽管这些活性物质可能是瞬时存在的，但可运用多种分析方法对它们给液体化学性质造成的影响进行测量和分析[13]。

氢是宇宙中最轻且分布最广的元素。在标准温度和压力下，它呈气态，沸点为-252.87℃。尽管如此，冷大气等离子体疗法能够引发显著的生物学反应，例如在癌细胞中产生过氧化氢，进而导致DNA和线粒体损伤、细胞内活性氧物质水平升高以及启动细胞凋亡过程。目前正在对其效应进行研究，以探索其在癌症治疗方面的潜在应用[14]。虽然氢气相对稳定，但它能与氧气结合生成水，从而释放能量。它还可参与众多化学反应，包括加氢和还原反应等。

2.1. 产生方法及递送系统

冷大气等离子体是一种在接近环境温度下产生的电离气体，富含包括过氧化氢和亚硝酸盐在内的活性氧和活性氮物质（RONS）[14]。氦气、空气和氩气是常用于产生冷大气等离子体的气体，等离子体射流是主要的产生技术。将冷大气等离子体应用于细胞或组织最常用的方式是直接使用等离子体射流或经等离子体处理过的介质[15]。冷大气等离子体可能改变干细胞微环境或直接辐照干细胞，从而影响干细胞的命运，包括黏附、增殖、分化及死亡。经冷大气等离子体处理过的水凝胶已被设计用于定位并释放活性氧和活性氮物质（RONS），确保其长效释放的同时减少全身性扩散[16]。冷大气等离子体通过产生活性氧和活性氮物质（RONS）引发细胞反应，包括细胞凋亡、细胞活力降低以及线粒体损伤。此外，冷大气等离子体可通过增强细胞膜通透性来促进药物递送，通常需要等离子体诱导的电场与等离子体化学之间的协同作用。

在间充质干细胞疗法中，氢气的递送机制通常包括吸入、饮用富氢水或直接注入循环系统。众多研究已对这些策略进行了探究，以确保安全有效的给药方式。氢气可通过吸入、饮用富氢水或静脉注射富氢盐水的方式进行递送[17]。这些方法已证实可提高血液和组织中的氢浓度，而这对于其治疗益处至关重要。此外，由于氢气具有抗氧化、抗炎和抗凋亡的特性，在临床环境中已提倡吸入氢气用于治疗新冠肺炎肺炎[18, 19]。

2.2. 生物学相互作用

冷大气等离子体（CAP）在生物医学方面的潜在用途正日益受到更多研究，尤其是因其具备产生活性氧和活性氮物质（RONS）的能力。本综述探讨了冷大气等离子体与间充质细胞之间的联系，这对于众多治疗应用而言至关重要。通过将冷大气等离子体暴露与某些生物材料（例如含有负载氧化铁的二氧化硅纳米颗粒的材料）相结合，间充质干细胞（MSCs）能够更快地增殖并增强成骨分化[20]。

甚至经历了上皮-间充质转化（EMT）的癌细胞也易受到冷大气等离子体及等离子体活化介质（PAM）的选择性杀伤作用。这种选择性归因于间充质样癌细胞中活性氧物质（ROS）含量升高[21]。人类皮肤成纤维细胞和脂肪来源的基质细胞（ASC）在短暂暴露于冷大气等离子体后可能会呈现衰老表型。这种表型表现为DNA损伤、增殖受抑制以及促炎细胞因子的释放。尽管如此，这些细胞仍保留了一定的功能特性。冷大气等离子体诱导产生的活性氧和活性氮物质（RONS）能够与细胞成分相互作用，激活诸如Trk/Ras/ERK通路等信号通路，进而产生不同的生理后果，包括大脑发育。这凸显了冷大气等离子体产生的物质与细胞信号通路之间复杂的相互作用[22]。冷大气等离子体可能改变微环境，从而对细胞行为产生间接影响。微环境氧化还原状态的改变会影响细胞活力及细胞凋亡通路。

氢气已展现出显著的分子及细胞效应，这使其成为再生医学中一种具有潜在益处的物质，尤其在其对干细胞的影响方面[23]。一种与之类似的气态分子硫化氢（H₂S）能够影响癌细胞中的间充质-上皮转化（MET）并参与细胞信号传导。这可能会对解读氢在细胞过程中更广泛的功能产生影响，详见表1。

表1. H₂和CAP的性质及应用对比

3. 抗氧化机制

氢气（H₂）展现出强大的抗氧化特性，主要通过直接清除作用、激活Nrf2通路以及调节线粒体功能来实现。这些方式增强了其在应对氧化应激相关疾病方面的治疗功效。氢气（H₂）可作为自由基和活性氧物质（ROS）的清除剂，减轻羟基自由基和过氧亚硝酸盐的有害影响，同时保留具有重要功能的活性氧物质[24]。它们通过与细胞内如羟基自由基和亚硝酰自由基等强氧化剂相互作用并减轻氧化应激，从而发挥抗炎和抗凋亡作用。正如利亚姆·贝尔德（Liam Baird）和山本正之（Masayuki Yamamoto）在2020年所发现的那样，氢气（H₂）通过阻止Nrf2经KEAP1降解来促进Nrf2通路（抗氧化反应的关键调节通路），进一步促进Nrf2向细胞核内转位，从而启动抗氧化基因的产生。通过促进线粒体自噬、增加线粒体数量以及降低线粒体中的活性氧物质（ROS）水平，氢气（H₂）可提高脂肪来源干细胞的存活及生肌分化能力[18]。

4. 对间充质干细胞生物学的协同效应

4.1. 细胞存活与增殖

间充质干细胞可分化为多种细胞类型，包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经元、心肌细胞以及内皮细胞，这使其在再生治疗应用中颇具前景[25]。来自细胞的细胞内及细胞外环境的多种信号控制着干细胞样状态下的自我更新，包括增殖、分化以及迁移[26]。获取足够的细胞以启动细胞疗法是治疗应用中的一个限制因素。为获得合适的细胞数量而进行的长期体外细胞培养，可能会因长期培养诱导的应激而影响这些细胞的基因调控及分化能力。此外，间充质干细胞体内注射后的细胞死亡也是一个限制因素，因为大多数供体间充质干细胞在注射后会被清除，并不会大量植入受体系统[27]。这就需要一种更高效的细胞扩增机制，以促进细胞的高增殖率、高存活率以及分化。细胞外微环境可被改造以驱动细胞增殖、存活或分化。多项关于细胞外微环境的研究发现，细胞形状是一个重要因素[28]。其他研究表明，基质刚性[29]与细胞外基质蛋白提供的机械反馈相结合，可引导间充质干细胞分化[30]。根据最近的一项研究，间充质干细胞在分化过程中被自身改变之前，会通过早期的细胞外基质蛋白接收用于分化的生化信号[31]。所有这些研究都有力地表明，细胞外物理微环境会影响间充质干细胞分化，而在组织工程中，这种微环境可被改变以实现靶向细胞分化。

4.2. 分化能力

间充质干细胞（MSCs）是多能基质细胞，可分化为多种细胞类型，包括成骨细胞、软骨细胞以及神经元，如图2所示。间充质干细胞的分化能力受多种生化和生物物理参数调控，这些参数通常协同作用以引导细胞命运。本综述探讨了若干环境因素如何相互作用来调节间充质干细胞的分化能力。纳米尺度的表面形态与固定化生长因子一起，也能协同影响间充质干细胞分化。不同直径的二氧化钛（TiO₂）纳米管在涂覆骨形态发生蛋白-2（BMP-2）后，对间充质干细胞分化会产生不同影响。在100纳米纳米管上涂覆骨形态发生蛋白-2会促进软骨分化，而15纳米纳米管则刺激成骨分化。这意味着骨形态发生蛋白-2的横向纳米尺度间距提供了调节谱系特异性分化及细胞存活的环境线索[32]。在3D打印基质中，生化和结构线索的组合能够引导间充质干细胞发育，以实现靶向组织再生。

图2. 在特定生化和机械信号作用下，间充质干细胞分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的过程，该过程支持组织再生与修复。

4.3. 迁移与归巢

间充质干细胞归巢是一个涉及众多分子相互作用的多步骤过程。间充质干细胞与内皮细胞之间的相互作用首先涉及选择素的使用，随后是细胞因子引发的激活事件，接着通过整合素实现黏附，最后借助基质重塑因子的作用穿过内皮屏障，此后细胞通过血管外迁移进入趋化因子梯度[33]。参与间充质干细胞归巢的关键信号通路包括磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K - Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）以及Janus激酶/信号转导及转录激活因子（Jak/Stat）通路，这些通路会响应诸如基质细胞衍生因子-1（SDF-1）等趋化因子而被激活[34]。目前已对多种提高间充质干细胞归巢效率的方法进行了测试。通过对间充质干细胞进行基因操作使其过表达特定因子，例如成纤维细胞生长因子21（FGF21），已被发现可提高其迁移潜能并使其归巢至受损区域[35]。细胞表面修饰以及生物材料载体的使用是调节间充质干细胞迁移的其他重要因素。

4.4. 旁分泌效应

间充质干细胞因其强大的再生能力而闻名，这主要归因于其旁分泌活动的作用。有大量报道称，它们能产生多种生物活性化学物质，这些物质会影响周围细胞和组织朝着愈合及再生方向的行为。近来，在文献中也可以看到人们对微环境和生物材料通过提高间充质干细胞的治疗潜力来改变这些旁分泌效应的作用越发感兴趣。

已有研究表明，生物材料增强细胞间接触可提高间充质干细胞的旁分泌活性。因此，抑制N - 钙黏蛋白会显著降低间充质干细胞的旁分泌效应，这显然表明细胞间接触能够改变间充质干细胞的活性[36]。同样，对低温打印的分级多孔海绵的研究发现，这些支架可改善间充质干细胞的黏附、留存以及存活情况，增强细胞与材料之间的相互作用。间充质干细胞的协同效应详见表2。在这些海绵上培养的间充质干细胞展现出明显更好的旁分泌活性，包括免疫调节、血管生成以及成骨成分的生成量增加。间充质干细胞的旁分泌作用在多种再生过程中都发挥着重要作用。间充质干细胞的旁分泌效应是通过与细胞外基质、邻近细胞以及可溶性物质之间复杂的相互作用来调控的[37]。

表2. 对间充质干细胞生物学协同效应的展示

5. 对过氧化氢（H₂O₂）和冷大气等离子体（CAP）的协同效应

5.1. 相互作用的分子机制

过氧化氢（H₂O₂）和冷大气等离子体（CAP）的协同效应因其在医学和微生物消毒方面的潜在用途而备受关注。本综述旨在阐释过氧化氢与冷大气等离子体相互作用的分子机制，重点关注它们对肿瘤细胞及微生物消毒的联合效应。过氧化氢与亚硝酸盐（二者均为冷大气等离子体中的长寿命物质）的组合对于导致肿瘤细胞的选择性凋亡至关重要。过氧化氢与亚硝酸盐之间的反应会生成过氧亚硝酸盐，这是该过程的第一步。随后，过氧亚硝酸盐会与剩余的过氧化氢反应生成单线态氧，单线态氧会使肿瘤细胞表面的过氧化氢酶分子失活。过氧化氢酶的失活意义重大，因为这使得通常会被过氧化氢酶破坏的过氧化氢和过氧亚硝酸盐能够留在失活位点。这种留存会导致二次单线态氧的产生，进而进一步使过氧化氢酶失活，并形成一个单线态氧生成与过氧化氢酶失活的自持循环。

过氧化氢酶失活促进过氧化氢通过水通道蛋白进入细胞，耗尽细胞内的谷胱甘肽，并使细胞因脂质过氧化作用而对死亡变得敏感。此外，这一机制会产生细胞间诱导凋亡的次氯酸（HOCl）信号，该信号由活性的NADPH氧化酶1（NOX1）启动，并通过羟基自由基引发的脂质过氧化作用完成，激活细胞凋亡的线粒体途径。这一模型描述了冷大气等离子体（CAP）和等离子体活化介质（PAM）对肿瘤细胞的选择性影响，与之前认为冷大气等离子体或等离子体活化介质产生的活性氧物质/活性氮物质（ROS/RNS）足以直接导致肿瘤细胞死亡的理论相反[44]。

5.2. 互补抗氧化途径

多项研究表明，当多种化学物质混合时，它们会产生协同抗氧化效应。例如，已发现将槲皮素和儿茶素结合使用可极大地提高过氧化氢刺激的人肝癌细胞（HepG2细胞）的抗氧化活性。这种协同作用是由Keap1 - Nrf2信号通路介导的，其中BACH1起着负调控作用。槲皮素和儿茶素的存在刺激了let - 7a - 5p和miR - 25 - 3p的上调，这反过来又下调了BACH1，从而导致活性氧物质（ROS）生成减少以及细胞增殖增加[45]。同样，酚酸和类胡萝卜素在过氧化氢诱导的大鼠心肌细胞（H9c2细胞）中已被证实具有协同抗氧化效应。酚酸促进类胡萝卜素吸收以及膜转运蛋白表达，从而增强抗氧化反应。β - 胡萝卜素和咖啡酸的组合降低了细胞内活性氧物质水平并提高了细胞核内Nrf2水平，这表明酚酸通过激活类胡萝卜素膜转运蛋白产生了协同效应[46]。冷大气等离子体（CAP）和等离子体活化介质（PAM）已被发现对肿瘤细胞具有协同效应。冷大气等离子体中两种长寿命分子——亚硝酸盐和过氧化氢的相互作用会导致过氧亚硝酸盐的合成，进而产生单线态氧。这一过程使肿瘤细胞表面的过氧化氢酶失活，使得过氧化氢和过氧亚硝酸盐得以积累，并通过脂质过氧化作用和线粒体途径导致细胞死亡。这一概念强调了冷大气等离子体和等离子体活化介质对肿瘤细胞的特定影响，这种影响是由它们自身产生的活性氧物质和活性氮物质（ROS/RNS）介导的[44]。

5.3. 细胞存活的增强

已发现用低水平过氧化氢（H₂O₂）对细胞进行预处理能够提高它们对氧化应激的抵抗力。过氧化氢预处理通过上调转录因子Nrf2及其相关抗氧化酶来降低细胞内活性氧物质（ROS）水平，从而提高人类脂肪来源干细胞（hASCs）的存活率。此外，它还能减少促炎化学物质的释放，并调节细胞代谢以满足在氧化环境下生存所需的代谢需求[47]。

5.4. 优化及治疗参数

在冷大气等离子体及经等离子体处理的液体用于癌症治疗时，可利用细胞内过氧化氢的最大浓度来量化细胞对外源性过氧化氢的敏感性[48]。将冷大气压力等离子体射流（CAP）与过氧化氢（H₂O₂）相结合，通过增强活性物质的膜转运以及细胞内分子的氧化作用，在细菌消毒方面可产生显著的协同效应[49]。来自冷大气等离子体（CAP）或等离子体活化介质（PAM）的单线态氧会触发肿瘤细胞产生高浓度的二次单线态氧，使肿瘤细胞的保护性过氧化氢酶失活，并重新激活依赖活性氧物质/活性氮物质（ROS/RNS）的凋亡诱导信号[50]。过氧化氢表面处理可改善磷酸钙的表面性质和生物学性能，增强活性氧物质（ROS）生成并提高细胞相容性[51]。顺铂与冷大气等离子体处理相结合展现出协同抗癌效应，且对正常细胞的细胞毒性较低[52]。一种氢气自生成纳米平台可增强化学动力学疗法的疗效并提高芬顿反应速率，从而增强多模式协同治疗效果[53]。

6. 技术考量与优化

间充质干细胞（MSCs）是再生医学中最具前景的研究对象之一，它们能够分化为多种组织类型，并发挥免疫调节作用。优化间充质干细胞疗法的技术方面涉及多个层面，例如干细胞来源的选择，可来源于骨髓、脂肪组织以及脐带，并且要运用高效的分离技术，如流式细胞术或免疫磁珠分选法（MACS），以确保所获取的细胞群是纯净的[41]。对于质量控制而言，必须考虑适当的细胞特性鉴定，包括诸如CD73、CD90和CD105等表面标志物，以及用于评估分化能力的功能性检测[54]。递送方式——无论是静脉注射、肌肉注射还是局部给药——都必须能使间充质干细胞保留在目标部位；这可通过使用生物材料或进行基因改造来增强效果。

间充质干细胞的存活和功能取决于局部微环境，尤其受缺氧和炎症等因素影响。确切地说，治疗功效是通过旁分泌机制实现的，即间充质干细胞产生生长因子来触发组织修复[55]。仅基因工程这一方面就能增强间充质干细胞针对特定疾病或递送治疗药物的潜力，而将其封装在生物材料中则可起到保护作用并控制递送过程[56]。其他新兴技术包括纳米技术和3D打印，它们在该领域发展迅速，主要是通过改进间充质干细胞的递送方法以及组织工程技术来实现的。其他有前景的方法还包括个性化医疗，即根据患者的基因图谱及疾病的特定特征来匹配间充质干细胞疗法。

氢气（H₂）因其强大的抗氧化和抗炎作用，作为一种治疗剂正受到越来越多的关注，这使其成为间充质干细胞疗法中一种潜在有用的添加剂。为提高氢气在间充质干细胞应用中的治疗功效，需要仔细优化氢气的递送方式。氢气有多种递送途径[57]。每种途径都各有利弊。富氢水是另一种便捷、无创的递送系统；然而，氢气散失是水储存和饮用过程中的主要挑战之一。相关研究[58]证实了它对氧化应激介导损伤的保护作用。相比之下，注射方法虽然能实现定点递送，但正如[59]等研究报道的那样，存在组织损伤和栓塞的风险。

除此之外，在电解及金属 - 酸反应方面的氢气生成和储存系统也有所改进，不过过去的研究也揭示了效率和纯度方面存在的问题。氢气递送装置的设计应强调便携性、易用性以及与各种递送方法的兼容性，生物相容性是一个关键因素，[60]等研究已证明了这一点。通过更好地开发递送系统，研究人员能够进一步提升间充质干细胞疗法的治疗益处，尤其在氢气具有有益的抗炎和再生作用的疾病应用中更是如此。

冷大气等离子体（CAP）是一种在大气压下产生的非热等离子体，其特点是存在活性氧物质（ROS）和活性氮物质（RNS）、带电粒子以及紫外线辐射。这些特性可能使冷大气等离子体成为生物医学应用（特别是针对间充质干细胞）的一种潜在治疗工具。只有在对若干技术条件进行调整和优化的情况下，冷大气等离子体应用于间充质干细胞疗法才具有实际意义。在这些冷大气等离子体设备中，大气压等离子体射流（APPJs）通过介质阻挡放电能够产生均匀等离子体，并能在高输出功率下工作，但对电弧放电极为敏感，且设计复杂[61, 62]。滑动电弧与等离子体密度相比具有更强的穿透性，但存在危险性且容易造成热损伤[63]。

冷大气等离子体用于间充质干细胞疗法优化的其他重要因素是治疗参数。这些参数包括等离子体暴露时间、功率以及气体成分。研究表明，最佳等离子体暴露时间取决于预期的生物学效应以及间充质干细胞的类型[64]。等离子体功率对间充质干细胞的活力、增殖以及分化影响显著，有研究指出，较低功率水平通常对维持细胞功能最为有利[65]。此外，气体成分可进行定制，以激发间充质干细胞产生特定反应，从而促进诸如伤口愈合等过程[66]。例如，联合疗法也可通过利用与组织再生生长因子的协同效应来进一步增强冷大气等离子体的潜力。总之，优化冷大气等离子体设备的配置、治疗参数以及细胞培养条件，能够使冷大气等离子体成为增强间充质干细胞疗法、改善再生效果的有效工具。

氢气和冷大气等离子体在增强间充质干细胞疗法中的时机与持续时间

利用氢气（H₂）和冷大气等离子体（CAP）进行治疗的时机和持续时间至关重要，其本身就能对间充质干细胞疗法的有效性产生重大影响。已证实，在注射前用氢气对间充质干细胞进行预处理能够增强它们的存活、迁移以及分化能力。在间充质干细胞疗法过程中同时使用氢气可提高植入效果和治疗结果。氢气的治疗时长取决于待治疗的疾病状况：对于急性疾病，短期的氢气治疗可能就足够了，而对于慢性疾病则需要长期治疗。不过，治疗持续时间取决于疾病的严重程度、患者的反应以及潜在的副作用[67]。同样，冷大气等离子体治疗的最佳时机可以在应用间充质干细胞之前对组织进行预处理，在治疗过程中提高植入效果，并在之后通过基于间充质干细胞的疗法促进组织再生。冷大气等离子体的治疗周期与之类似：对急性疾病进行短期冷大气等离子体治疗是有效的，而慢性疾病则需要较长时间的治疗。就氢气以及冷大气等离子体治疗而言，质量控制至关重要。对于氢气，气体纯度、氢气浓度检测以及稳定性是最为重要的[68]。冷大气等离子体的质量控制涵盖等离子体参数，如功率、气体成分以及均匀性，同时安全措施旨在确保设备正常运行以及所产生生物学效应的效率[69]。优化氢气和冷大气等离子体治疗的时机、持续时间以及质量控制，能够显著提高间充质干细胞疗法在多种临床应用中的疗效。

简而言之，间充质干细胞疗法的优化确实需要在间充质干细胞来源、递送方式以及诸如基因工程、纳米技术和个性化医学等先进技术之间谨慎选择。

7. 临床应用与未来展望

7.1. 当前临床现状

氢气和冷大气等离子体在增强间充质干细胞疗法方面的当前临床状况较为乐观，但仍处于起步阶段。[70]所开展的研究近期着重强调了氢气的抗氧化和抗炎特性，从而增强了间充质干细胞的存活、迁移以及分化能力。因此，它们可能为缺血性心脏病、器官衰竭或炎症引发的疾病开辟新的治疗途径。尽管如此，仍有必要开展大规模随机试验，尤其是鉴于标准化递送方法和剂量测定方面存在的挑战。一篇综述[71]强调了人们对将氢气用于干细胞疗法日益增长的兴趣；然而，该综述也强调了获取更充分的临床证据以验证其疗效和安全性的重要性。

氢气（H₂）的治疗应用已在众多临床试验中得到检验，其给药方式也针对多种疾病（如中风、糖尿病和炎症性肠病）进行了评估。然而，展示氢气与间充质干细胞（MSC）联合治疗具体数据的报告数量非常有限。需要开展大规模随机对照试验来确定这种联合疗法的临床疗效。在一些实验中，已证实氢气可能有助于缓解氧化应激和炎症，而这二者是体现间充质干细胞治疗潜力的不同指标。诸如[72]等研究表明，由于氢气可用作医用气体，人们对其兴趣日益浓厚。不过，仍然存在诸多挑战，例如吸入和富氢水等不同递送方式以及剂量方面的差异，这使得在各种临床环境下对氢气疗法进行标准化变得复杂。此外，目前还缺乏用于准确量化组织中氢气浓度的标准化流程，这限制了定制治疗方案的能力。

表3展示了冷大气等离子体（CAP）和氢气的众多不同临床试验，这些试验表明它们具有良好效果，尤其在伤口愈合及其他皮肤病相关应用方面。在将冷大气等离子体与间充质干细胞联合应用时，后者产生活性氧物质/活性氮物质（ROS/RNS）的特性发挥了优势，尽管专门聚焦于间充质干细胞疗法这一问题的临床试验相对较少。其中一些研究表明，冷大气等离子体治疗可提高间充质干细胞的再生能力，即增强其在组织修复方面的有效性[73, 74]。除了临床应用外，患者的安全问题给长期暴露于相关治疗手段带来了挑战。另一方面，冷大气等离子体设备在配置和剂量测定方面存在巨大差异，且缺乏统一的治疗参数，这些都阻碍了该疗法的标准化进程。需要开展更多研究来进一步强化这些技术方面的工作。

表3. 氢气和冷大气等离子体的临床试验及结果

7.2. 潜在治疗应用

氢气（H₂）和冷大气等离子体（CAP）如今代表着先进的手段，在改善间充质干细胞疗法方面展现出巨大潜力。氢气强大的抗氧化和抗炎作用，以及冷大气等离子体改变细胞行为从而促进组织再生的特性，二者独特的结合能够选择性地调节细胞和组织的生化特征。已证实这可通过其抗氧化和抗炎特性来提升间充质干细胞的治疗潜力。氢气可减轻氧化应激并调节免疫反应，而这有助于间充质干细胞的存活、迁移和分化，为有效的干细胞疗法营造有利的微环境。

氢气一直被视为一种可增强缺血性病症治疗效果的物质，在缺血情况下，组织会因血液供应不足而受损。图3展示了氢气的治疗应用情况。氢气的抗氧化活性有助于逆转因缺血后的再灌注损伤所导致的氧化损伤。在中风方面，氢气通过提高细胞和神经元的存活及修复能力，增强了间充质干细胞在缺血性中风治疗中的有效性[77]。在心肌梗死的情况下，氢气能够保护心脏组织免受缺血 - 再灌注损伤，因而具备改善心脏病发作后患者心脏功能的潜力。在外周动脉疾病及其他类似疾病中，氢气通过对氧化应激和炎症的调节作用来保护组织免受缺血性损伤。氢分子具有神经保护作用，因此有望作为间充质干细胞疗法治疗神经退行性疾病的辅助手段，它能够减轻大脑中的氧化应激和炎症，提高间充质干细胞的存活率以及向神经细胞分化的能力。

图3. 氢气的临床应用

就阿尔茨海默病而言，有证据表明氢气能够预防与该疾病相关的氧化应激，并改善认知功能的保持情况。临床前研究表明，吸入氢气可为多巴胺能神经元提供神经保护，并延缓帕金森病的恶化。氢气因其抗炎特性，在炎症性疾病中颇具益处[79]。通过减轻炎症和氧化损伤，氢气可增强间充质干细胞在慢性炎症病症中修复和再生组织的能力。氢气能够减轻类风湿关节炎的症状，因为它可抑制促炎免疫反应，从而增强间充质干细胞修复和再生受损软骨的能力。在结肠炎的临床前模型中，氢气被证实可通过减轻肠道炎症发挥积极作用[80]。间充质干细胞的存活和迁移在改善氢气促进伤口愈合方面展现出良好前景。它能够促进诸如糖尿病溃疡、烧伤和压疮等难愈合伤口的愈合[80]，如图3所示。

冷大气等离子体是一种部分电离的气体，能产生活性氧和活性氮物质（RONS），已知这些物质会参与细胞的增殖、迁移和分化等功能。冷大气等离子体在间充质干细胞疗法用于伤口愈合、癌症治疗及其他临床应用方面具有巨大潜力。在促进组织再生和推动慢性伤口愈合方面，冷大气等离子体已得到广泛研究。冷大气等离子体与间充质干细胞疗法相结合产生的协同效应在细胞增殖和组织修复方面似乎更具优势。冷大气等离子体与间充质干细胞联合应用可通过加速血管生成并降低感染风险来加速糖尿病溃疡的愈合[76]。冷大气等离子体对诸如皮炎、银屑病和痤疮等皮肤病也有强效作用。凭借其杀菌作用，它还能抑制炎症并促进皮肤再生，因此是许多皮肤病治疗中的一种有用试剂[81]。冷大气等离子体已被证明在癌症治疗中具有作为辅助手段的潜力，因为它能够介导对癌细胞的选择性杀伤，并且还可增强化疗和放疗的效果[82]。氢气与冷大气等离子体在间充质干细胞疗法中的结合呈现出协同效应，增强了间充质干细胞的整体治疗潜力。这种双重作用可能会全面提升细胞的增殖、迁移、分化和存活能力，从而在所有可设想的治疗应用中带来更好的治疗效果[78]。然而，未来的研究应致力于规范治疗方案、优化剂量并确保临床环境中的长期安全性。相关应用情况如图4所示。

图4. 氢气和冷大气等离子体的治疗应用

7.3. 间充质干细胞疗法中联合应用氢气和冷大气等离子体的潜在挑战及解决方案

在间充质干细胞疗法中，将氢气（H₂）与冷大气等离子体（CAP）相结合是一个复杂的过程，会带来诸多需要慎重考虑的挑战。一些挑战包括需要优化剂量以及使用此类疗法的监管问题。使用氢气对间充质干细胞进行预处理的最佳剂量尚不明确；长时间暴露可能因副作用而有害。应通过广泛的临床前和临床研究来确定氢气的最佳给药剂量[83]。应通过长期随访研究来评估长期风险。为确保安全性，应持续监测氧化应激和炎症指标。由于在不同研究和临床环境中应用氢气和冷大气等离子体的方案未能标准化，导致治疗结果存在差异。这需要研究机构、企业和监管机构之间相互协作，制定应用氢气和冷大气等离子体的统一流程[84]。氢气和冷大气等离子体的生产及应用成本较高。这会给希望接受此类疗法的患者带来费用负担。为提高氢气生产及冷大气等离子体设备的成本效益而进行的研究投资，应与企业开展合作，助力扩大其生产和配送规模[84]。间充质干细胞存在的问题是它们可能引发不良免疫反应，进而导致排斥现象。需要针对氢气和冷大气等离子体的免疫调节特性进行优化，以降低这种风险。

采用免疫抑制剂进行联合治疗或对间充质干细胞进行基因改造以降低其免疫原性，可应对排斥问题。临床前研究应评估氢气和冷大气等离子体能否促使间充质干细胞实现免疫逃逸[85]。技术方面的挑战在于，很难高精度地制造和安装冷大气等离子体设备。由于已开发的设备存在差异以及治疗参数不一致，导致治疗结果缺乏一致性。对医护人员进行正确使用相关设备的适当培训，将确保治疗的一致性和可重复性。冷大气等离子体产生的自由基虽然有益，但如果不加控制，可能会导致氧化应激和细胞损伤[44]。冷大气等离子体能够轻易地操控细胞增殖和分化命运，若作用于错误部位，则可能导致不良的治疗结果[65]。如果氢气与冷大气等离子体之间的相互作用未能妥善协调，可能无法产生最佳效果。应在临床前对氢气和冷大气等离子体的协同效应进行检验。对时间、顺序以及剂量 - 反应的研究将指明最佳治疗时机，以便实现最大效益[44]。在间充质干细胞疗法中使用氢气并联合冷大气等离子体，在伦理和监管层面带来了额外的挑战。在实施治疗前，监管机构和伦理方面会关注患者的知情同意及安全问题[67]。通过开展合作研究、实现技术突破以及精心规划监管措施来应对这些挑战，最终将促使氢气和冷大气等离子体成功融入间充质干细胞疗法中。

8. 结论

随着将氢气（H₂）和冷大气等离子体引入间充质干细胞疗法，引出了几个前景可观的研究方向，这些方向可能会显著提高间充质干细胞的治疗功效。首先，了解氢气和冷大气等离子体对间充质干细胞产生影响的分子层面机制被认为至关重要。对特定分子通路的进一步研究将详细阐释这些物质如何在细胞增殖、分化以及组织再生的背景下改变细胞功能。研究表明，这可提高间充质干细胞疗法中的细胞存活率和分化能力。此外，如[46]所示，同时使用氢气和生长因子有可能证明可针对不同目的优化间充质干细胞疗法。这可能为个性化医疗铺平道路，即根据患者的特征和反应来定制治疗方案，如[25]所示的例子那样。长期随访研究对于评估这些治疗效果的持久性和可持续性至关重要。诸如[66]等研究工作将有助于确认并确立基于氢气和冷大气等离子体强化作用的间充质干细胞疗法的疗效和安全性，这对于临床转化至关重要。最后，与冷大气等离子体设备相关的先进技术可通过如[68]中所述的方式进一步提高治疗的精准性和有效性。同样，如[86]等针对氢气疗法的基于纳米颗粒的递送系统研究，有可能在尽量减少不良反应的情况下促进治疗反应的提升。