最近在进行ac4C-seq数据分析时，从GEO上下载了Cell文章“Acetylation of Cytidine in mRNA Promotes Translation Efficiency”的原始数据，发现GSM2724031这个原始文件的Q30竟然是100%。于是总结下，供大家参考。

 1，GEO数据库简介

1，芯片，测序原始数据仓库。基因组，转录组，修饰等，但是不存蛋白质谱和代谢数据

2，发文章一般都要上传原始数据，保证数据的可重复性，真实性

3，大量数据共享，可挖掘发文章：没有数据，挖掘GEO；数据不够，GEO来凑

4，数据质量参差不齐，需要自行甄别

2，Illumina测序仪下机Fastq原始数据格式

 3，质量分数Q计算方法

Q=−10 log10(P)

P是碱基识别的错误概率，来自碱基识别算法（base calling algorithm）并依赖于多少信号被捕获。

 Q30值一般用百分比展示，表示Q值大于30的碱基比例。例如Q30=85.75%表示这个（或者双端时R1+R2）fastq文件的全部total个碱基中，有total*0.8575个碱基的Q值都大于30。所以Q30是衡量数据质量的一个很重要的标准。Illumina官方以80%为阈值，实际中一般可以做到95%，甚至更高。虽然理论上Q30可以是100%，但是目前还做不到。

4，测序质量分数为什么越往后越差？

Illumina测序技术基于边合成边测序（Sequencing by Synthesis）的原理，利用DNA聚合酶在模板DNA上逐个添加荧光标记的dNTP，从而实现对DNA序列的测定。在测序初期，由于合成反应尚未完全稳定，因此虽然DNA聚合酶的活性较高，但在高质量区域（通常指测序的前1-30个碱基对）内可能会出现一定的波动。随着测序的进行，合成反应逐渐稳定，但随着时间的推移，DNA聚合酶的活性会逐渐降低，导致特异性下降，从而增加了后续测序过程中出错的概率。

在Illumina测序中，随着DNA聚合酶活性的降低，测序错误率也会随之升高，这可能是由于聚合酶保真度降低以及二代测序固有的特点导致的。

5，GEO和SRA的区别

GEO最开始是存储的芯片数据，包括芯片原始文件，处理过的表格等。后来测序出来后，GEO也开始存储测序的数据，再后来由于原始数据越来越多，越来越大，为了区分就又重开了个存储测序原始数据的SRA。上传到GEO的原始fastq也会随后存到SRA里边。所以，对用户来说，区别就是数据上传到SRA时，可以不用上传processed data，而上传到GEO时，必需上传processed data。

• GEO数据库的数据结构包括Platform（GPL）、Sample（GSM）、Series（GSE）和Dataset（GDS）。GSE通常指代一个研究项目，GSM是单个样本的数据，而GDS是整理后的数据分析集。

• SRA数据库的数据结构包括Studies（ERP/SRP）、Experiments（SRX）、Samples（SRS）和Runs（SRR）。Studies代表研究课题，Experiments代表实验设计，Samples代表样本信息，而Runs代表测序结果集

6，GEO/SRA对原始fastq的处理

原始下机fastq文件在上传GEO/SRA后，工作人员会对其进行处理，将每条read的测序仪相关信息（read name）去掉，替换成诸如1、2、3，或者是SRR123456.1，SRR123456.2这种序列编号（2018年前的可能会保留read name信息）。

7，GEO/SRA原始fastq下载

一般直接使用sratoolkit来下载。命令为：

prefetch -X 200G SRR123456 -o SRR123456

fastq-dump --split-files -F SRR123456

8，GEO/SRA的fastq文件都是原始下机数据吗？

一般是原始下机数据（read长度完全一样），但是也有去接头之后的clean数据（长度不一样）。

我们来看看GSM2724031的原始文件，下载后，转成fastq文件。

发现这个fastq的质量分数全是?，而其他原始数据不存在这个问题，推测GSM2724031样品的原始fastq文件在上传GEO前，fastq里边的质量分数被人为替换了，替换的原因就无从知晓了，也许“这世界就是个巨大的草台班子”。

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