1998年，正在美国做博士后的孔道春听说细胞如果缺少了细胞周期检查点（checkpoint）的调控，停顿DNA复制叉就会发生垮塌，导致DNA复制不能完成；这样，细胞或者生命就失去了赖以生存的基础。这提起了孔道春强烈的兴趣。七年后，在北京大学，孔道春开始全力研究这个问题，试图阐明细胞周期检查点如何调控维持停顿复制叉稳定。

人类细胞染色体DNA上大约有几百万个DNA复制叉障碍点，这些障碍点导致DNA复制叉停顿。停顿的复制叉是不稳定的，它们需要严格的细胞调控以维持其稳定。 如果细胞调控发生缺陷，停顿DNA复制叉会发生垮塌，导致基因组严重变异。人们估计大约三分之二的癌症发生可能与复制叉不稳定所导致的DNA复制错误相关。自上个世纪60年代末70年代初发现裂殖酵母rad3ATR基因突变株以来，科学家们就对细胞如何调控维持停顿DNA复制叉稳定的机制研究投入了大量的精力。 大家一直在试图回答该领域的两个最基本问题：1）为什么停顿的DNA复制叉会不稳定；2）细胞调控维持停顿DNA复制叉稳定的核心机制是什么。在2021年，孔道春实验室回答了这两个问题：他们发现停顿复制叉不稳定的根本原因是由于复制解旋酶与DNA聚合酶的物理分开，导致它们在生化功能上的脱偶联；细胞维持停顿复制叉稳定的核心机制是维持复制解旋酶与DNA聚合酶的功能偶联、维持复制体的完整性。进一步，孔道春实验室还发现了一条新的细胞调控通路以维持停顿DNA复制叉稳定。他们发现DNA复制叉停顿后，停顿复制叉周围的染色质结构变得更加紧密，并阐明紧密染色质结构阻止复制解旋酶离开停顿复制叉或DNA聚合酶，使得复制叉稳定。他们命名这条细胞调控通路为chromsfork (Chromatin compaction stabilizes stalled DNA replication forks) 调控。 Chromsfork 调控通路的发现，还解决了一个生命科学领域存在了一个多世纪的核心问题：即触发异染色质/紧密染色质结构的信号是什么，或染色质的基本结构是怎么来的。

有关DNA同源重组的研究已经超过了100年，科学家们确定同源重组由三个基本步骤组成：末端降解，链入侵，及解开Holliday连接。末端降解是DNA同源重组的第一步，它在末端切除5’-ssDNA链的数千到数万个核苷酸以产生3’-ssDNA单链。在末端切除过程中，为什么3’-ssDNA不被切除，谁保护了它？孔道春团队通过艰苦细致的工作发现，RNA polymerase III催化产生了一个与 3’-ssDNA链互补的RNA链，并形成了RNA/DNA杂交链，这个杂交链保护了3’-ssDNA链不被降解。

孔道春实验室的核心课题是真核细胞DNA复制起始机制。真核细胞DNA复制起始的核心步骤是在DNA复制源上装配一个蛋白复合体，叫pre-RC (pre-replicative complex)。自上个世纪70年代初至今，总共确定了5个蛋白参与pre-RC的形成，即ORC、Cdc6、Cdt1、MCM、Sap1/Gridin。 美国冷泉港Bruce Stillman实验室确定ORC，孔道春实验室确定Sap1/Girdin复制起始蛋白，Cdc6、Cdt1和MCM由多个实验室的工作共同确定。

基于上面这些基础研究，我们对生命体如何传承遗传物质DNA及维持遗传物质相对稳定的分子机制有了更深的理解。现在我们就看看孔道春的贡献吧。

 生命体遗传物质的传承

自最原始的生命体开始出现在地球上，生命体已进化了10亿～20亿年。生命体进化的根本目的是使其遗传物质能更好地得到传承。为准确传承遗传物质，生命体进化出两大生物事件：一是遗传物质 DNA分子的复制；二是维持DNA分子相对稳定的多个生化机制。在过去50年，科学家对真核生物的这两大生物事件进行了广泛和深入的研究，有了多个突破性发现，极大地促进了我们对遗传物质传承的分子机制的理解。 20世纪50～80年代，DNA复制方面的研究主要集中在原核细胞和真核细胞DNA复制叉里的生化反应、确定作用于DNA复制叉的酶和蛋白因子（如DNA聚合酶、解旋酶、拓扑异构酶、单链结合蛋白、DNA连接酶等）及阐明它们的生化作用机制。自20世纪70 年代开始一直到现在，DNA复制的研究主要是阐明真核细胞DNA复制的起始机制，这需要解决3个问题：阐明DNA复制起始位点的结构；确定复制起始蛋白及它们的作用机制（核心研究）；阐明复制起始的严格调控机制。DNA复制起始，首先要在DNA复制起始位点上形成一个复制起始复合物，这个复合物称为复制前复合物（pre-replicative complex，pre-RC）。从20世纪70年代初至今，历时50年的研究，共确定了5个pre-RC组分，它们分别是ORC、Sap1/Girdin（Sap1 是裂殖酵母蛋白，Girdin是Sap1在高等真核生物的同源蛋白）、Cdc6、Cdt1和MCM。在细胞G1期，这5个蛋白因子组装成pre-RC。ORC是美国冷泉港Bruce Stillman实验室确定的；Sap1/Girdin是北京大学孔道春实验室确定的；Cdc6、Cdt和MCM是由多个实验室共同确定的。pre-RC在细胞的G1-S转折期被激活。然后，作用于DNA复制叉的蛋白质和酶被募集到DNA复制起始位点，起始DNA复制［图 12-1（a）］。最近，孔道春实验室进一步确定裂殖酵母到人的DNA复制起始位点拥有两个特定的必需序列，分别被ORC和Sap1/Girdin结合。至此，从20世纪60年代末到现在，经过近50年的研究，裂殖酵母到人的DNA复制起始位点结构得到最终阐明。

图 12-1 真核细胞 DNA 复制相关机制

 （a）真核细胞DNA复制起始机制。DNA复制起始的第一步，是在DNA复制起始位点上形成一个复制起始复合物，这个复合物由 ORC、Sap1/Girdin、Cdc6、Cdt1和MCM组装而成。（b）细胞周期检查点调控Dna2和CMG复制解旋酶等防止停顿复制叉倒转，并稳定复制机器。（c）复制叉调控紧密染色质结构形成，以维持停顿复制叉稳定；同时，该调控机制导致异染色质结构形成。（d）在 DNA 同源重组及同源重组介导的 DNA 双链断裂（DSB）修复生物事件中，RNA 聚合酶Ⅲ催化形成的RNA-DNA杂交链是一个必需的修复中间体，其生化作用是促进5′-链末端切割及保护新生成的3′-ssDNA单链CDK. cyclin-dependent kinase，细胞周期蛋白依赖性激酶；DDK. Dbf4-dependent kinase，Dbf4 依赖性激酶；ATR. ataxia telangiectasia and Rad3-related protein，共济失调、毛细血管扩张和 Rad3 相关蛋白；Chk1. checkpoint kinase 1，细胞周期检查点激酶 1；CMG. Cdc45-MCM-GINS complex，CMG 复合物；HMT. histone methyltransferase，组蛋白甲基转移酶；ac. 组蛋白乙酰化修饰；me. 组蛋白甲基化修饰；HDAC. histone deacetylase，组蛋白去乙酰化酶；Dna2. DNA replication ATP-dependent helicase/nuclease 2，DNA复制ATP依赖性解旋酶/核酸酶 2；RPA. replication protein A，复制蛋白A；EX01. exonuclease 1，核酸外切酶 1；RNAPⅢ. RNA Polymerase III，RNA 聚合酶Ⅲ

为维持遗传物质 DNA 分子的相对稳定，细胞进化出了两大途径：一是维持 DNA复制叉的稳定，使得DNA复制不被中途停止，并防止基因的广泛突变；二是DNA修复，细胞已进化出多条DNA损伤修复通路。DNA复制过程中，复制叉会碰到上百万个复制障碍（人类细胞），使得复制叉停顿下来。停顿的复制叉是不稳定的，容易垮塌，导致 DNA 复制不能完成及基因组的极度不稳定。为了维持停顿复制叉稳定，细胞进化出两条通路：一条称为细胞周期检查点（cell cycle checkpoint），另一条称为复制叉调控（chromsfork control）。细胞周期检查点调控是Leland Hartwell实验室在 1988 年发现的。其中，孔道春实验室发现细胞周期检查点通过调控 Dna2、复制叉解旋酶 CMG（Cdc45-MCM-GINS）等来维持停顿复制叉稳定［图 12-1（b）］。复制叉调控是北京大学孔道春实验室近期发现的一条新的细胞调控通路。复制叉调控是通过调控染色质结构，在停顿复制叉周围形成紧密的染色质结构，以维持停顿复制叉稳定。复制叉调控还有一个极其重要的生物功能，即促进异染色质形成［图 12-1（c）］。异染色质组成了染色体的基本结构。正因为有异染色质结构或紧密染色质结构的存在，基因表达水平才可通过表观遗传学（epigenetics）机制得以精准调控，并在器官形成和个体发育中起着决定性作用。

DNA修复对于维持遗传物质DNA的稳定起着极其重要的作用。DNA双链断裂（DNA double-strand break，DSB）是细胞内最严重的一种 DNA 损伤。在真核细胞中，DNA双链断裂主要通过非同源末端连接和同源重组两种方式进行修复。非同源末端连接是直接将 DNA断裂末端连接起来的一种修复方式，而同源重组需要先将DNA 双链断裂末端的5'-DNA链进行几千到几万个核苷酸的切除，由此产生3'-单链DNA，并以它来入侵同源模板链并进行随后的DNA合成和断裂修复。这里一个长期未解决的关键问题是进行5'-DNA链有限切割时，3'-DNA链是如何被保护的？最近，北京大学孔道春实验室解决了此问题。RNA聚合酶Ⅲ通过在DNA双链断裂末端转录，将断裂末端 5'-单链DNA翘起从而促使其被Dna2核酸酶降解，而RNA 聚合酶Ⅲ转录形成的RNA链与断裂末端3'-单链DNA形成RNA-DNA杂交链，该RNA-DNA杂交链作为同源重组过程的必需中间体来保护3'-单链DNA免于被降解［图 12-1（d）］。