精读韩博士的文章，个人认为NgAgo实验中有几个可能比较重要的问题需要考虑。不管重复实验的目的是质疑、证实或是其它，起码作者在文中已经提及的注意事项不应该忽略。本文还试图以个人经验判断哪些是韩实验中需要特别注意的问题，但限于本人水平，说的也许是错的，请专家指正。

1.       溶解DNA的水的pH不用纠结，转染时其体积仅为培养基的1/100，不会对培养基的pH产生有意义的影响；

2.       细胞生长：韩在文章中多次强调了“Since NgAgo follows ‘one-guide faithful’ rule, i.e. guides can onlybe loaded when NgAgo protein is in the process of expression”，强调NgAgo在表达后才与gDNA结合。细胞应处于活跃生长期才能大量表达蛋白，因而，“90% confluence of the cells on harvesting isideal. Cell overplating significantly weakens the efficacy of genome editing.”表明这个实验中NgAgo要发挥功能，不要以为细胞收集越多越好，而是生长活性越高越好。建议收集对数生长期细胞，而不是平台期细胞。同时建议转染前利用无血清培养基等方法对细胞进行同步化，可以使蛋白表达时间更统一（这不是韩博士提到的）；

3.       转染频次：蛋白表达一般在转染后24-48 hr开始，表达可持续3天。我一开始考虑如果需要多次导入gDNA，应该在24 hr后再加转一次，而不是韩博士说的首次后“8，12，24 hr”。然而，从这个实验中表明NgAgo表达后结合gDNA的时间窗在0-12 hr内，若推迟24 hr再转gDNA则结合量明显减少（图2b）。这意味着需要为NgAgo准备足够量的gDNA，让它们一被表达就有guideDNA结合，一旦表达后超过12 hr没有gDNA，它们结合gDNA的能力就大大下降了（不知道为什么）；

图2b

4.       gDNA的纯度是不是问题？当然是。从图S1第5、6道可以看出，若5‘-P的无关序列（NC）与NgAgo结合，切割作用就没有了，即使再加入设计gDNA（FW）共孵育也不行。考虑到一般情况下设计gDNA纯度应该足够高，且NgAgo似乎不与没有5’-P的ssDNA/ssRNA或者5‘-P的ssRNA结合（图2a），所以这个问题应该不是重点；

图S1

图2a

5.       与Cas9-gRNA系统比较：Cas9-gRNA可以在体外结合形成核蛋白复合体后再送入胞内，这在一定程度上可以保护gRNA不在胞内降解，而纯化的NgAgo不能在体外结合gDNA（37℃）（图2c）。这说明这两种蛋白在作用机制上不太一致。NgAgo必须与gDNA共转才能体现酶切作用。共转能结合，共孵育不能结合（图S1），这是我很难理解的地方之一。我只能猜测当NgAgo表达后非常容易与5’-P-ssDNA结合，一旦没有这样的“底物”将很快失活，即使提纯NgAgo也已失去活性；

图2c

6.       定位问题：原核生物没有核膜，NgAgo发挥作用没有胞内定位问题。而在真核生物中，NgAgo和gDNA的定位应该是个问题。这也是我发现韩博士在做基因组编辑（图4）时特别提到设计了NLS-NgAgo的原因（NLS：nuclear localization signal），并有图S4表明表达的NLS-NgAgo确实能够定位于核内（在Addgene给出的NgAgo质粒也是NLS-NgAgo）。但作者并没有提到gDNA的定位。由于NgAgo会在内质网表达后再定位于核内，NgAgo-gDNA复合体是在胞质内形成？还是进入细胞核内才形成？还是根本不形成复合体，是由gDNA入核，与靶序列结合后引导NgAgo来切割？从文章的描述中尚无法判断机理。我个人猜测第三种可能性更大些，这解释了共转才能结合，共孵育就不结合的原因。由于ssDNA使得dsDNA解旋必须与NgAgo的结合同步，这也可能是NgAgo基因组编辑成功率较低的原因；

图S4

综上，NgAgo可能真的比Cas9难实现得多，应该需要改进。