目录

• 前言

• 新型冠状病毒肺炎（COVID-19）临床诊断中RT-PCR方法的假阴性问题

• RT-PCR方法对检测设备或平台要求较高

• 核酸检测耗时较长

• 急需快速准确诊断COVID-19的方法

• COVID-19临床诊断中抗体检测法假阳性的原因

• 新型冠状病毒（SARS-COV-2）抗原检测法的优势

• SARS-COV-2抗原快速检测试剂盒简介

• COVID-19抗原法快速诊断的优势

前言

2019年底，中国武汉发现了新冠综合症（COVID-19），其病原体最早由中国科学家鉴定为一种不同于以往的新型冠状病毒，并第一时间向全球发布了其全基因序列，病毒最初定名为2019-nCoV。由于其序列及感染症状与2003年引起SARS爆发的冠状病毒相似，世界病毒学会将其定名为SARS-COV-2。现在，该病毒已经引起世界范围COVID-19大规模流行，目前已有累计超过64万人被确诊，死亡人数超过3万人，这一数字仍在快速增长。

COVID-19症状表现

面对来势汹汹的传染病的大规模流行，大量人群需要被筛查、确诊并做相应的处理，临床对诊断试剂的需求极为迫切。除口罩、防护服等医疗用品外，在武汉疫情早期以及现在的意大利、西班牙等国都出现了检测试剂的巨大缺口。对于病原体的检测，PCR（聚合酶链式反应）方法是可以最早被应用的方法。制备病毒核酸特异性引物序列相对较快，核酸检测的理论特异性和灵敏度都很高，因此基于PCR方法的病毒核酸检测试剂盒成为此次针对新冠病毒检测最早被开发的试剂盒。在中国的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》中，实时荧光RT-PCR阳性被作为新冠病毒感染的确诊证据之一。然而，在实际诊断过程中，核酸法却暴露出很多问题：

第一，  假阴性问题；

第二，  设备或检测平台要求较高；

第三，  检测时间较长；

新型冠状病毒肺炎（COVID-19）临床诊断中RT-PCR方法的假阴性问题

首先，假阴性意味着漏检，不仅会导致临床中对疑似患者不能快速确诊，而且会使漏检者成为潜在的病毒传染源。其次，据报道，甚至出现了多次核酸检测阴性而出院的患者又再次复发的情况，也很可能属于假阴性引起的误诊。

理论上核酸检测法特异性和灵敏度都是比较高的，低含量的病毒仍可以被检测到。造成“假阴性”这一问题可能与多种因素有关，大致分为采样问题、试剂盒问题及阳性标准问题这样几个方面。

1.    采样问题：

1.1  呼吸道标本：

由于新冠肺炎最常见感染肺及下呼吸道（还包括其它组织感染），因此样本中病毒载量肺泡灌洗液>痰>咽拭子，当使用咽拭子采样时，病毒载量可能较低，检测结果取决于所用试剂盒的最低检测限；

1.2  取样操作标准化：

取样位置、力度等需要标准化；

1.3  样本制备及保存：

1)    首先，临床样本一般采集量有限，这对核酸提取存在挑战。其次，样本中可能存在多种复杂成分影响核酸的提取。而如果核酸提取纯度低，将影响下游的PCR反应，因此当病毒总量低时，容易造成假阴性结果；

2)    由于呼吸和饮食都通过咽部，咽部存在大量微生物，样本采集过程中会不可避免混入核酸酶。核酸酶稳定性很高，一般的灭菌等清除或抑制试剂很难完全消除酶活性，它会造成样本中核酸被降解，核酸检测缺乏模板，因而检测结果为阴性；

2.    试剂盒问题：

2.1  试剂盒本身设计造成的灵敏度问题：

1)    由于核酸检测试剂盒设计时需要在特异性和灵敏度之间平衡，比如使用多重PCR可以提高特异性，但多对引物之间的相互干扰可能会造成灵敏度降低。但如果不使用多重PCR，则一旦所选则的靶位点核酸序列产生突变，就会造成试剂盒失效。因而检测阴性可能与试剂盒的设计有关；

2)    由于疫情发展严重，大量试剂厂商在抢时间生产，这可能造成试剂之间的精准度有差别。

3.    阳性标准问题：

阳性病例需要经过综合判断，之所以称为“假阴”通常是通过临床症状等确认为阳性。但临床症状可能与病程发展有关，病程初期及经过抗病毒治疗后，病毒载量可能较低，造成核酸检测阴性。

RT-PCR方法对检测设备或平台要求较高

在采样后，核酸检测还包括核酸提取和PCR扩增两个步骤，所采用的试剂盒和设备包括核酸提取试剂盒、荧光探针、以及荧光RT-PCR仪等。高灵敏度的RT-PCR仪价格不菲。另外，为避免空气中各种微生物可能带有的核酸酶的影响，核酸检测对实验室的洁净度要求也较高。最后，核酸检测是一项精密的实验，对操作人员的要求也较高，需要经过专门的操作培训。这使得在大规模疫情爆发时，各大医院具有核酸检测资质的实验室很快被饱和，大量样本堆积无法及时获得检测。

荧光RT-PCR仪

核酸检测耗时较长

完成一个RT-PCR的检测通常需要4-6个小时，然而考虑到样本运输、大量样本积压的情况，通常最快24小时才可以报告结果。据报道，在湖北，将样本送到实验室要花几个小时，而结果的发布要花几天时间。当地卫生部门表示，这些实验室每天可以进行6千个检测，但是工作人员全天候工作，也没有足够的实验室能够应付这样的工作量。

急需快速准确诊断COVID-19的方法

由于核酸检测在诊断中所暴露出的问题，除CT等临床症状指标外，临床医生急需一种能够快速诊断COVID-19的方法，能够实现对人群的大规模筛查。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》中，将病人血清学指标，针对新冠病毒的特异性抗体IgM或IgG阳性，作为诊断标准之一，该方法被称为抗体检测法。

抗体检测法基于人体对于外源病原体的免疫反应。当感染病原体后，人通常在7-10天在血清中出现针对该免疫原的特异性抗体IgM，它们是机体抗感染的“先头部队”。如果血清中检出病原体特异性IgM，提示新近发生感染，可用于感染的早期诊断。通常在20天后，可以检测到针对病原体的特异性IgG。

人体在病原刺激后的体液免疫反应曲线

然而在实际诊断过程中，抗体检测法却暴露出多种问题，不能单独作为诊断指标用于筛查，只能作为当核酸检测为阴性时的辅助诊断方法。在FDA的SARS-COV-2检测指导中明确指出，抗体检测不能单独用于新冠病毒诊断，不能排除感染或说明感染状态。有其它病毒如HKU1、NL63、OC43或229E等的既往或现时感染时抗体检测也可能呈阳性。

FDA新冠病毒检测指导（Issued on the web on March 16, 2020.）

COVID-19临床诊断中抗体检测法假阳性的原因

首先，假阳性诊断将使得未感染的人被送至隔离点，有可能造成感染，其密切接触者被隔离，也造成社会资源的浪费。

SARS-COV-2（或2019-nCoV）特异IgM和IgG抗体检测出现假阳性的原因是什么？根据国家临床检验中心的分析，主要是由于阳性判断值的设定、样本的内源和外源干扰物质造成。但从根本上讲，是由于大部分抗体检测试剂盒在方法学上的固有缺陷造成的。

1.    阳性判断值的设定

每种检测试剂盒在研发时，都需要通过对大量阴性和阳性样本的检测，得出检测结果分布图，如下图所示。阴性和阳性样本的检测值往往会有一定交叠，这意味着一部分弱阳性结果实际上为假阳性。因此，需要设定合理的阳性判断值，以减少假阳性的产生；

2.    样本中的干扰物质

2.1   内源性干扰

内源性干扰物质一般包括类风湿因子、嗜异性抗体、补体、因使用鼠抗体治疗或诊断诱导的抗鼠Ig 抗体等。在日常的临床血清（浆）样本中，有相当比例的样本不同程度的含有上述各种干扰物质，从而可能导致测定结果的假阳性。

2.2   外源性干扰

外源性干扰物质包括样本溶血、样本被细菌污染、贮存时间过长和凝固不全等。

3.    采样时间窗问题

由于机体体液免疫发生的时间因人而异，采样时待检人员血清中病毒特异性IgM或IgG的水平可能处于不同的阶段，会造成检测假阴或假阳性问题。

4.    方法学缺陷

大部分抗体检测试剂盒采用捕获法ELISA原理实现对特异性抗体的检测。即通过抗IgM/IgG的抗体，捕获样本中的IgM或IgG。如果是病原体特异性的IgM或IgG，它将结合带有标记的抗原，从而在试纸条的检测线或96孔板的相应孔中显现出来。由于捕获抗体（抗IgM/IgG抗体）会结合血清中的任何IgM或IgG，因此该方法的特异性仅基于一对抗原-抗体的特异性识别和结合（即血清中的抗体识别试剂盒所提供的病毒蛋白）。这造成了在复杂的样本成分中，由于非特异性结合而引起的假阳性。

捕获法ELISA原理图

新型冠状病毒（SARS-COV-2）抗原检测法的优势

抗体识别和结合抗原上的某个表位（或抗原决定簇），如果这个表位序列与其它非靶点蛋白的某段序列或表位相似，则可能造成抗体与非靶点蛋白结合，这称为交叉反应（Cross-reactivity）。交叉反应是免疫反应普遍存在的一种现象。

交叉反应

如果使用两种抗原特异性抗体去识别和结合一个靶点抗原的不同表位，则可以大大降低这种交叉反应的几率。简单的数学描述就是，假设一个抗体与非特异靶点的交叉反应几率为1/100，当使用两种不同表位抗体识别时，这个几率将降为1/10000。两种抗体检测一种抗原的检测方法被称为双抗夹心法，抗原检测试剂盒多采用这种方法。

双抗夹心法ELISA原理图

SARS-COV-2抗原快速检测试剂盒简介

依据双抗夹心ELISA原理，通过免疫层析技术制备的新冠病毒抗原快速检测试剂盒核心组成如下图所示，样本滴加在样本垫上，通过液相层析依次通过结合垫，NC膜上的检测线（T线）和质控线（C线）。

抗原快速检测试纸条示意图

结合垫内含有标记的抗原特异性抗体，可以与样本中的抗原（病毒蛋白）发生结合，当液流到达检测线（T线）时，固定在这条线上的第二种抗原特异性抗体再次与抗原结合，将会呈现阳性结果。质控线（C线）包被IgG抗体，可以结合样本垫中抗体，用于判断层析过程是否顺利。

抗原检测试剂盒反应原理

下图分别显示阳性、阴性和测试失败的情况。如果质控线（C线）未显色，则测试失败，需要重新检测。

抗原检测试剂盒结果判断

COVID-19抗原法快速诊断的优势

为满足快速诊断的需求，利用免疫层析技术开发的快速检测试剂盒具有很多优点：

• 快速

检测一个样本仅需10-15分钟，可以做到现场快检。RT-PCR方法需要4-6小时才能得到检测结果，且由于设备等原因，不能做到现场快检。

• 操作简便，无需特殊设备和人员培训

RT-PCR方法检测需要荧光定量PCR仪。

•  特异性高

双抗夹心法保证了抗体交叉反应低，从而有效提高了免疫学方法的特异性，减少假阳性的发生。

• 灵敏度稳定

理论上，由于核酸检测可以将病毒模板扩增，其灵敏度高于免疫学检测方法。但在实际临床使用中，由于前述对样本制备的要求较高，造成核酸法诊断假阴性较高。而免疫学方法对样本的要求相对较低，抗原蛋白较稳定，因而抗原检测试剂盒灵敏度表现稳定。

新型冠状病毒综合症（COVID-19）实验室诊断方法比较：

总之，新型冠状病毒（SARS-COV-2）抗原检测法可有效避免RT-PCR法的假阴性和抗体检测法的假阳性问题，诊断快速、准确、对设备和人员要求低，其特点非常适合大规模新冠病毒感染疑似病例的快速排查，对疫情集中暴发的快速诊断非常有效。也可以作为出院病例核酸检测的再次确诊方法，避免假阴性患者出院造成新的传播风险。