使用β疱疹病毒载体传播性疫苗推断吸血蝙蝠种群中狂犬病循环的中断

Griffiths ME， Meza DK， Haydon DT， Streicker DG

意义

野生动物病毒的溢出造成全球健康和经济负担，并且在很大程度上仍然是不可预防的。阻断野生动物宿主体内病毒传播的疫苗可能会防止病毒外溢，但面临着向偏远和隐居的野生动物群体提供疫苗这一尚未解决的挑战。利用良性病毒作为自我传播疫苗提供了一个可能的解决方案。在吸血蝙蝠中发现的β疱疹病毒是针对吸血蝙蝠狂犬病的可传播疫苗的潜在候选载体，吸血蝙蝠狂犬病是拉丁美洲狂犬病的重要来源，但其在自然蝙蝠种群中的传播动力学仍然未知。使用流行病学模型和现场获得的病毒基因组数据，我们模拟了未来基于β疱疹病毒的疫苗可能如何传播。我们展示了其高疫苗覆盖率和长期预防狂犬病爆发的能力。

摘要

可传播疫苗是一种新兴的生物技术，有希望消除野生动物种群中的病原体。这种疫苗将对天然存在的非致病性病毒(“病毒载体”)进行基因修饰，使其表达病原体抗原，同时保留其传播能力。众所周知，目标野生动物种群中候选病毒载体的流行病学很难解决，但这是在疫苗开发的重大投资之前选择有效载体的基础。在这里，我们使用时空复制的深度测序来参数化圆形叶口蝠贝塔疱疹病毒(DrBHV)，一种针对吸血蝙蝠传播的狂犬病的传播性疫苗的拟议载体。使用在6年内收集的36个毒株和地点特异性流行时间序列，我们发现具有潜伏期和再激活周期的终生感染，与高R0(6。9;CI: 4。39至7。85)，是解释在野生蝙蝠中观察到的DrBHV感染模式所必需的。这些流行病学特征表明，DrBHV可能适合作为终身、自我加强和可传播疫苗的载体。模拟显示，给一只蝙蝠接种DrBHV载体狂犬病疫苗可以免疫超过80%的蝙蝠群体，将狂犬病爆发的规模、频率和持续时间减少50%至95%。预计接种个体的传染性疫苗会逐渐丧失，但可以通过接种更大但实际上可以达到的蝙蝠种群比例来应对。使用可获得的基因组数据对流行病学模型进行参数化使可传播疫苗的实施更近了一步。

为野生动物感染宿主接种疫苗可以保护脆弱物种，防止威胁人类健康和经济生计的病原体外溢(1， 2)。成功的宿主疫苗接种策略必须免疫足够比例的宿主人群，以改变流行病学动态。例如，大规模分发充满疫苗的诱饵已经控制或消除了美洲和欧洲部分地区的食肉动物狂犬病(2， 3)。不幸的是，可扩展的疫苗接种对于生活在难以接近或未知的地方或饮食与诱饵递送系统不相容的野生动物来说仍然具有挑战性(4)。虽然通过直接接触从治疗个体传播到未治疗个体的“可转移”疫苗(即，仅一代转移)正在开发中，但故意限制这种疫苗的空间和时间范围将需要持续的疫苗接种运动(5)。通过感染过程自主传播的疫苗(“可传播”疫苗)在理论上有能力克服这些挑战(6–9)。提出了遗传修饰良性、未减毒和宿主特异性病毒的可传播疫苗，所述病毒已经在宿主群体中循环，以表达来自靶病原体的免疫原性转基因(7)。理想情况下，这种重组病毒疫苗将保留野生型载体的特征，一旦释放给少数个体，允许其通过宿主宿主群体传播。

尽管理论上有希望，但传染性疫苗的管理应用尚未实现。这部分反映了对将具有复制能力的重组病毒释放到自然群体中的前景的保守态度(10)。因此，预测疫苗释放的结果需要了解控制载体病毒在其天然宿主中传播的生物学机制(11， 12)。由于自然系统中的大量混杂因素，即使对于具有大量先前存在的数据的人畜共患病毒来说，最终确定野生动物体内的维持机制也是极具挑战性的。即使在整合了来自长期监测研究、实验感染和/或公共卫生监督的数据后，不确定性仍然存在(13–16)。对于候选的可传播疫苗载体来说，挑战要大得多，因为这些载体往往缺乏可以告知其自然宿主物种内种群动态的历史数据。事实上，一些理论模型研究已经显示了疫苗传播的潜在好处和挑战，但迄今为止还没有人使用来自目标宿主人群中候选载体的数据来说明特定载体-病原体-宿主系统可能如何应对可传播的疫苗释放(6–8， 17， 18)。鉴于密切相关的病毒，或者甚至不同宿主物种中的相同病毒，可能具有不同的宿主内和宿主间动力学[例如，发病机理、流行率、复制率和传播(19)]，研究目标宿主和预期的病毒载体对于避免无效的疫苗释放或对本质上不合适的疫苗平台的错误投资至关重要。

吸血蝙蝠传播的狂犬病病毒是一种狂犬病病毒这在拉丁美洲大部分地区造成了严重的人类健康和农业负担(20， 21)。VBRV管理目前包括使用毒药扑杀蝙蝠、人类暴露前和暴露后接种疫苗(22)，以及牲畜的暴露前疫苗接种；然而，这些措施成本高昂，并且未能遏制狂犬病在一些国家不断增加的爆发或其向新边界的传播(23)。鉴于预防狂犬病爆发的困难，新的生物技术，如可传播疫苗，可以帮助从源头上解决狂犬病问题。我们最近发现了一种候选的可传播疫苗载体，圆形叶口蝠贝塔疱疹病毒(DrBHV )，在表面上健康的秘鲁吸血蝙蝠中高度流行，似乎仅限于感染普通吸血蝙蝠和可能密切相关的蝙蝠物种(24， 25)。由于β疱疹病毒(BHVs)在健康宿主中的低致病性、高宿主特异性以及表达外源转基因(7， 26)。我们进一步表明，大多数蝙蝠携带多种DrBHV毒株，重新取样的蝙蝠在其一生中经常获得额外的毒株(即“重复感染”的能力)。如果保存在疫苗中，重叠感染所暗示的保护性交叉免疫的缺乏将使得具有已确定的野生型DrBHV感染的蝙蝠能够免疫(24)。因此，DrBHV满足宿主特异性、低毒力、高流行能力和重复感染的核心传播性疫苗先决条件。然而，作为DrBHV种群动态基础的宿主内机制，以及决定其作为疫苗的免疫学和流行病学特性的bat种群生态学和行为，仍然是未知的。

在这里，我们使用纵向采样吸血蝙蝠的深度测序数据来评估DrBHV的一系列可能的传播模型。这些包括通过潜伏期和再激活的终生感染周期维持BHV的传统模型(27–29)。鉴于我们先前观察到DrBHV的检测在个体中随时间而变化(24)，我们还考虑了允许病毒清除和感染阶段特异性可检测性变化的模型。我们将最大似然框架应用于2013年至2018年间秘鲁五个生态区(七个行政区)的36个特定毒株流行时间序列(24) (图1)并使用最佳支持传播模型来评估预期疫苗传播的范围(30)。使用先前开发的VBRV传播模型，我们接下来量化了可传播的DrBHV载体疫苗对VBRV爆发的潜在影响(16)。最后，由于任何传播性疫苗释放的最可能的长期进化结果是回复到非疫苗野生型，我们评估回复对针对VBRV的长期和短期疫苗接种策略的影响(31)。

结果

从空间复制的特定应变时间序列推断模型结构。

我们研究了吸血蝙蝠群体中DrBHV传播的八种竞争模型，代表了基于其他β疱疹病毒传播的假说(27， 32)和早期关于DrBHV的发现(24) (图2A)。每个模型都建立在基本的易感-感染模型框架(33， 34)，其中个体天生易感并进入受感染类别(IH)在速率上β。我们假设a)DrBHV不会导致受感染蝙蝠发病或死亡，b)共循环DRB HV毒株之间没有明显的竞争(尽管我们在后面的模型中放宽了这一假设)。我们还在每个模型中加入了一些机制，通过这些机制，先前DrBHV阳性的个体可以在随后的观察日期变成阴性，这是基于从纵向取样的个体(24， 25)。

图2模型拟合选择易感-感染-潜伏传播模型。（A)根据数据测试的每个模型(0至VII)的示意图。为了清楚起见，省略了人口统计过程。未填充的状态代表未感染的蝙蝠，而填充的状态代表已感染的蝙蝠。暗灰色填充表示这种状态被认为是可通过所有模型中的测序检测到的；浅灰色填充表示仅在面板中标记为“b”的模型中通过测序可检测到DrBHVB。 (B)对数似然和δAIC分数(零表示最适合的模型以红色突出显示)，用于每个测试模型的MLE。模型结构中带下划线的字母表示哪些感染状态被认为可通过测序检测到。标有“NA”(不适用)的对数似然值表示模型中没有参数集符合纵向样本数据给出的感染检测要求。

在模型I易感-感染-易感(SIS)中，个体以速率γ从感染中恢复并再次变得易感。模型II和III扩展了模型I以包括“恢复”或“免疫”隔室(MH)，受感染的个体以一定的速度向其转移γ。个体要么保持对DrBHV的免疫直至死亡(模型II，易感-感染-康复(SIR))，要么以一定速度丧失免疫力χ并返回易感区室(模型III，易感-感染-恢复-易感(SIRS))。模型IV(易感-感染-潜伏(SIL))扩展了该框架，以包括活跃(IH)和潜伏(LH)感染，如在其他β疱疹病毒(32)，在那里只有主动感染的蝙蝠才能传播。其余的模型在模型IV的基础上进行扩展，纳入了无免疫的感染清除(模型V)、终身免疫(模型VI)和暂时免疫(模型VII)。对于每一个包括潜伏期的模型(模型IV到VII)，我们探索了方案a )，其中只有活性感染可通过测序检测到，和b)其中活性和潜伏感染均可检测到。我们假设通过深度测序的检测是二元的，例如100%的活性感染被检测到，0%或100%的潜伏感染被检测到。我们在一个简单的SI模型(模型0)中放宽了这些假设，并测试了一系列检测率，使得该模型能够随着时间的推移在个体中产生应变损失观察。中提供了每个模型的全部细节和常微分方程(ODEs)材料和方法部分和SI附录。

鉴于缺乏DrBHV的实验感染研究，所有模型参数都是估计的。具体而言，我们使用基于似然性的推断方法将随机房室模型(如上所述)拟合到来自Illumina deep测序的36个数据集，每个数据集描述了给定毒株在给定位置随时间的流行率(图1)。我们首先探索参数组合以获得每个传播模型的最大似然估计(MLEs )，然后使用从这些MLEs得出的AIC (Akaike信息标准)值来确定最适合的传播模型。该模型拟合的参数范围是根据在其他物种中研究的β疱疹病毒确定的。我们使用从纵向采样的个体吸血蝙蝠(N = 14只蝙蝠和29个样本；SI附录，表S2和S3) (24)。具体而言，通过重复模拟先前观察到的DrBHV感染阳性个体的感染状态随时间的变化，我们为每个参数集产生了预期观察损失的比例(即，由于清除或潜伏期而不再可检测的毒株的比例)。然后，我们将这些预测与纵向数据集进行比较，并排除不能产生观察到的应变损失模式的参数组合。一旦确定了最适合的模型，就进行全网格搜索以产生每个参数的可能性分布。

模型四(潜伏期和再激活周期的终身感染，SIL)是最适合的模型，模型一至七中没有一个模型能合理地解释数据(所有替代模型的δAIC > 18，图2B)。模型IV有三个参数，它们的最大似然估计值已经获得；β(遗传率)= 1.10 (95% CI: 0.78至1.25)、γ(1/感染期)= 2.00 (95% CI: 2.00至2.47)、ω(1/潜伏期)= 6.00 (95% CI: 4.97至6.00)(SI附录，图S1)。这些参数转化为6个月的平均感染期和2个月的平均潜伏期，表明蝙蝠平均主动脱落病毒的时间是DrBHV潜伏期的3倍。相应的基本再现数(R0)，计算球棒的寿命(Eq. 1), ，为6.9 (95%可信区间:4.39至7.86)。我们还通过将模型IV扩展到包括两个感染类别(模型IV-i，SI附录，图S2)。模型IV-i的性能与模型IV相当(δAIC < 2 )，并且具有相似的R0估计(R0= ~6.1， β1= 2.65，β2= 0.88)。而活跃感染的急性期比ⅳ型短(γ1= 9.5)，随后的感染期比平均潜伏期(γ)长3至4倍2= 1.85和ω = 7.68)，表明急性感染期的增加并没有从根本上改变DrBHV感染的最可能的宿主内动力学。模型0的表现也与模型IV和IV-i相似(δAIC < 2)，传输速率β = 0.55。然而，模型0仅在检测率为50%至70%时是可信的(MLE检测率= 53%)。考虑到以前观察到的总体毒株特异性流行率高达65% (>90%的局部流行率)，如此低的检测率表明> 100%的蝙蝠实际上被感染。此外，由于显示出毒株丢失的bat对其它DrBHV毒株仍然是阳性的，因此漏检很可能代表特定毒株中的低病毒载量，这有效地收敛于模型IV。鉴于这些观察结果，尽管模型IV的复杂性增加，并且模型IV与其他疱疹病毒传播相似，但模型IV的AIC低于模型0，我们将随后的分析集中于模型IV。在竞争力较弱的模型中，包括潜伏期的模型一致性排名高于病毒清除的模型，通过深度测序仅可检测到活动性感染的模型比潜伏感染也可检测到的模型表现更好(图2B)。总之，这些结果表明，尽管DrBHV的基本传播生物学与人和鼠巨细胞病毒的相似(即，间歇性再活化的终身感染) (32)，吸血蝙蝠的活跃感染时间和潜伏感染时间之间的比率似乎与这些系统不同，在这些系统中，潜伏期通常比活跃感染时间长(35)。在潜在的DrBHV载体疫苗中，具有长活跃感染期的终身复发可能允许接种的个体由于重复再暴露于疫苗插入物而定期增强他们自身的免疫力，以及促进疫苗向新世代的持续传播。

DrBHV传输的长期和短期动力学。

在SIL模型(模型IV)下，DrBHV达到稳定的人群流行状态(以下称为“平衡流行”)，反映了在最佳条件下DrBHV载体传播性疫苗的潜在覆盖范围(以下称为“平衡覆盖范围”)。然而，考虑到疫苗开发所需的遗传操作可能会降低传染性(36)，我们假设R来计算均衡覆盖率0范围从0到8的值(估计R的上限0CI)。在MLE R传播的疫苗0DrBHV值(6.9)预计达到84%的平衡覆盖率，在任何时间点，63%的蝙蝠被主动感染，21%被潜伏感染。在R的MLE Cis内0，均衡覆盖率达到78%到88%之间(图3A)。R的值0低于置信下限仍然产生显著的均衡覆盖。例如，一种带有R0= 2(不到估计的95%置信区间下限的一半)预计可为平衡状态下的50%蝙蝠群体接种疫苗。

图3平衡时的DRB HV:DRB HV逐渐扩散到蝙蝠种群的大部分。（A)DrBHV载体疫苗与R0从0-MLE，总感染、活跃感染和潜伏感染。虚线表示最大似然比0值和阴影区域，CI下降到该值周围的下限。（B)示例DrBHV在完全易感人群中传播的随机模拟0，黑人的总患病率在12年左右达到平衡，而活跃状态和潜在状态之间继续波动。（C)DrBHV载体疫苗的平衡流行率(MLE和MLE较低CI R0)在已经感染了野生型DrBHV的人群中，交叉免疫从0到1。（D)MLE和MLE下CI R达到平衡(在最终平衡覆盖率的10%以内)所需的时间(年)0并且当在t = 0时接种1只蝙蝠时，交叉免疫为0比1。

而平衡患病率值和R0DrBHV的预测值很高，SIL模型假设传播分布在蝙蝠一生中发生的所有传染期[平均为8.36年(37)，在每个感染阶段产生相对较低的传播率(β = 1.1)。因此，DrBHV的患病率在首次引入后缓慢增加。在释放单个接种的蝙蝠后达到平衡覆盖率需要12 y(图3B和D)。等待时间的长度在R的95%置信区间内没有明显变化0，所以在很大程度上不会受到R适度下降的影响0来自基因操控。

尽管吸血蝙蝠的现场数据与不同DrBHV毒株之间的竞争或交叉免疫不一致(24)，同株再感染可能会受到现有免疫的阻碍。如果一种疫苗被释放到一个已有原毒株传播的群体中，或者如果一种疫苗回复到可传播的野生型，这种同毒株交叉免疫就可能出现。因此，我们研究了疫苗和以平衡流行率传播的原始野生型毒株之间不同水平的交叉免疫(0-100%)的影响。有了完全的交叉免疫，疫苗就无法入侵。然而，交叉免疫< =50%仅将MLE的平衡覆盖率降低至约79%(降低5%)0 (图3C)。交叉免疫的水平对疫苗传播率有更大的相对影响，50%的交叉免疫使达到平衡的等待时间增加一倍以上(大约。27年；图3D)。DrBHV传播参数和交叉免疫水平的敏感性分析(SI附录，表S4)表明，模型预测对传播率最敏感，其次是交叉免疫，并支持我们以前的结果，即平衡患病率比传播率对交叉免疫的变化更不敏感。疫苗传播对野生型DrBHV的中等水平的交叉免疫似乎是强有力的，这在理论上可以阻止疫苗传播，但可能需要增加初始疫苗应用水平来抵消较慢的疫苗入侵。

接种疫苗人群中的狂犬病动力学。

解决了DrBHV的自然传播生物学后，我们接下来模拟了它作为可传播狂犬病疫苗的应用，使用了一系列可能的R0VBRV的值(0.6至2)(5， 16)。我们模拟了疫苗覆盖率为0-84%(平衡覆盖率)的人群中的疫情，疫苗效力(E)为70-100%，可防止暴露后发生致命和传染性狂犬病(38)。在由MLE参数和100%疫苗效力产生的平衡疫苗覆盖率下，我们观察到爆发规模减少了94%(所有VBRV R0)，爆发频率减少75%，爆发持续时间减少70%(图4)。在疫苗效力较低(E = 0.7)的情况下，爆发指标的减少较低，但仍然很大，平衡疫苗覆盖率使爆发规模减少了82%，爆发频率和持续时间减少了大约一半(分别为47%和50%)。由于遗传操作导致的传播率降低导致疫苗传播效率降低0= 2且平衡覆盖率= 50%)或通过增加交叉免疫水平(90%交叉免疫且平衡覆盖率= ~50%)仍可使狂犬病爆发的规模、频率和持续时间分别减少约60-75%、28-45%和30-40%(所有VBRV R0疫苗效力为70-100%)(图4)。这些结果表明，由于DrBHV尚未达到平衡或由于疫苗传播减少而引起的较低覆盖率仍将有益于狂犬病控制。

图4疫苗覆盖面的扩大降低了狂犬病病毒爆发的规模、频率和持续时间。（A)爆发规模(即在爆发过程中死于狂犬病病毒的蝙蝠总数)，(B)频率(即，引入的蝙蝠感染至少一个其他个体的模拟的百分比)，以及(C)不同程度狂犬病病毒R的爆发持续天数(即从引入第一只患狂犬病的蝙蝠到种群中不再有患狂犬病或暴露的蝙蝠的时间长度)0。点显示以下各项的平均值A和C根据1，000次模拟计算得出，在这些模拟中，一只患狂犬病的蝙蝠被引入到一个预先接种了疫苗的群体中x轴。病原体和疫苗传播都发生在模拟过程中。在每个模拟中，测试了1和0.7的疫苗效力，其中E = 0.7以降低的不透明度显示。（D–F)与未接种疫苗人群中的疫情相比，每个疫情指标的减少百分比。虚线显示了所有VBRV R的平均降低百分比0DrBHV MLE R达到的疫苗覆盖率值0处于平衡状态。每个图中的红色虚线和阴影区域表示疫苗覆盖率和DrBHV载体疫苗的95% CI0价值。

通过增加接种的蝙蝠种群的初始比例(图5A)。在MLE DrBHV参数下，在没有交叉免疫的情况下，在接种10%的蝙蝠种群后，大约30%的疫苗覆盖率可在< 2年内实现，或者在接种20%后< 9个月内实现，并且在100%和70%疫苗效力下，可将狂犬病爆发的平均规模减半(图5A)。根据疫苗效力，需要更高的覆盖率(约65%至84%)来实现爆发频率和持续时间的同等减少，但这一覆盖率水平仍可在< 5年内达到，如有必要，可通过增加接种工作来加快。增加人群中对野生型病毒的交叉免疫水平会大大减缓疫苗的传播，在50%的交叉免疫下，同样的努力达到30%的疫苗覆盖率所需的时间增加了大约三倍。在更高水平的交叉免疫(80%)下，这种策略作为短期控制方法的效用降低，但在非狂犬病流行区作为长期控制措施仍有益处。

图5随着时间的推移，增加接种对狂犬病爆发规模的影响。（A)用最大似然估计达到不同的人口覆盖水平(达到均衡)所需的时间0当t = 0时接种的人群百分比增加时。结果显示了与循环前野生型DrBHV不同水平的交叉免疫(0%、50%和80%)。虚线显示了将狂犬病爆发的平均规模减少50%所需的疫苗覆盖率(~30%)，疫苗效力为70%至100%。该值是所有三个狂犬病病例的平均值0价值观。（B)t = 0时，接种人群每增加5%，爆发规模的额外减少百分比。每一列显示了狂犬病病毒爆发规模在R0= 2和DrBHV R0在MLE。在接种疫苗后的上述时间点将单只患狂犬病的蝙蝠引入该群体。低于5%阈值的所有值都以灰色显示，0%以白色表示，低于5%阈值时，疫苗接种努力增加5%产生的爆发规模减少不到5%。在查看器中打开

为了确定一个地区的最佳部署策略，考虑到初始接种努力和狂犬病引入前的预期等待时间，我们测量了初始接种努力每增加5%狂犬病爆发规模的额外减少。接种更高比例的人群对狂犬病病毒爆发规模的减少具有递减的回报，随着额外接种努力的中断，超过5%的额外接种使爆发规模减少< 5%，这取决于接种疫苗后狂犬病进入人群的时间尺度。我们考虑了接种疫苗后0、1、2和4年狂犬病爆发的情况。如果没有先前的疫苗传播(即接种后立即引入狂犬病)，额外接种益处的截断发生在大约55%的初始接种努力(图5B)。当疫苗被允许传播时，截断发生在疫苗传播1年后约42%的接种努力，2年后约27%，4年后约12%。在所有时间点上，当接种了< 20%的蝙蝠时，最大的益处(相对于最初的接种努力，暴发规模的减少)出现。先前的标记-再捕获研究表明，通常在一个晚上捕获不到10%的吸血蝙蝠群体(23)，因此令人鼓舞的是，绝大多数疫情的减少都可以发生在这种疫苗应用的现实水平上。鉴于在较晚的时间点观察到传播的最大益处(当引入交叉免疫时，这种模式变得更加极端)，疫苗接种工作必须结合狂犬病风险因素来决定，包括吸血蝙蝠中狂犬病的本地发病率，以及相关时间范围内的溢出可能性。

疫苗丢失对疫苗覆盖率和狂犬病传播的影响。

成功应用可传播疫苗的一个主要障碍是疫苗可能通过几种机制从个体中逐渐丢失。首先，转基因丢失或沉默会使疫苗返回到其野生型状态，产生回复的病毒体，其在没有不需要的基因的适合度成本的情况下，胜过疫苗(17， 36)。这种竞争也可能发生在已经在人群中传播的野生型DrBHV毒株上。或者，如果疫苗株由于遗传操作引起的低适应性或宿主免疫系统识别增强而灭绝，那么疫苗损失可能会简单地发生，而与竞争无关。我们研究了在不考虑潜在机制的情况下，单个宿主的疫苗损失(以下称为“宿主逆转”)如何影响用于狂犬病控制的DrBHV载体传播性疫苗释放的可行性。

具体来说，我们修改了DrBHV传播模型，使其包括宿主从主动疫苗感染状态回复到仅携带空病毒载体，有效地回复到野生型DrBHV(即半波(Half Wave))。我们假设恢复的蝙蝠不再传播狂犬病免疫版本的DrBHV，但可以传播野生型版本。此外，我们假设存在来自感染的变化的适应性交叉免疫，使得恢复的蝙蝠可以在稍后以由比例常数ρ介导的降低的速率再次感染疫苗，如在早先介绍的双品系竞争模型中(图6A)。首先，我们计算疫苗是否能在人群中达到非零稳态0从1到8不等。在MLE R0，疫苗保持在每年每只蝙蝠< 0.9次逆转的平衡状态。平均而言，这一比率相当于疫苗感染后1年内所有接种过疫苗的蝙蝠的损失。随着更频繁的逆转，疫苗最终从蝙蝠种群中消失(图6B)。其次，我们在MLE R上评估了疫苗和回复载体之间交叉免疫的影响0 (图6B)并表明交叉免疫水平的提高降低了疫苗维持循环所能耐受的逆转率。在50%交叉免疫的情况下，疫苗只能达到每年每只蝙蝠< 0.5次逆转的正平衡状态。

图6宿主逆转对长期和短期疫苗覆盖率的影响。（A)DrBHV的传播模型示意图，其中接种的宿主回复为携带野生型毒株的回复宿主(I半波(Half Wave))的速率η。灰色表示蝙蝠对VBRV免疫。（B)使疫苗在宿主群体中达到正平衡状态的疫苗基本繁殖数(1至8)和宿主回复率(0至2)的组合(左边的)。虚线表示在最大似然比下存在平衡覆盖的最大回复率0。对回复载体的交叉免疫和MLE R中宿主回复率的组合0DrBHV的(对吧)。

为了研究抵消宿主逆转的短期影响所需的接种增加程度，我们模拟了0-100%人群接种后4年的疫苗传播，考虑了不同水平的交叉免疫(0%、50%和80%)和宿主逆转(每年每只蝙蝠0-10次宿主逆转，因此每年10次逆转相当于初次感染后平均1.2个月后的逆转) (17)。在接种后1年和4年，逆转降低了疫苗的传播性，在较长的时间点观察到最大的影响(SI附录，图S3)。这意味着与短期相比，逆转对疫苗接种活动的长期成功具有潜在的最大影响。在每年每只蝙蝠超过5次逆转的情况下，逆转平台期和可传播疫苗的影响接近常规疫苗的有效覆盖率。在每只蝙蝠每年约2次逆转的情况下，在4-y标记处将狂犬病爆发规模减半所需的初始接种努力为30%，相比之下，在没有逆转的情况下为< 10%。这种相对适度的增加，在所有水平的交叉免疫中相似，表明某些水平的逆转可以通过增加接种来耐受和抵消，尽管最大化疫苗稳定性和最小化适应成本将是生产有效的可传播疫苗的关键，这种疫苗可以以较低的努力产生长期效益。

讨论

可传播疫苗为阻止再次出现的人畜共患病在其宿主内传播提供了诱人的机会，从而限制了向人类和牲畜群体的蔓延。β疱疹病毒是可传播疫苗载体的主要候选物(11， 26， 28， 29， 39–41)，但由于对β疱疹病毒衍生疫苗如何在重要宿主物种的自然种群中传播的认识不足，实际应用部分受到阻碍。通过将纵向现场采样数据与深度测序和数学模型相结合，我们已经确定了支持DrBHV野生型传播的最可能的机制和参数，这将决定其作为针对吸血蝙蝠狂犬病的可传播疫苗载体的应用。此外，我们已经表明，这种传播水平有望显著减少狂犬病传播，进而有助于防止溢出事件，即使在面临交叉免疫和疫苗逆转的情况下。

开发可传播疫苗的一个未解决的挑战是需要在释放到野外之前了解传播的动态结果，或者在疫苗开发和测试中的实际昂贵投资。在缺乏野生宿主很少获得的体内系统的情况下，与房室模型配对的时间序列现场数据提供了一些辨别长期病毒维持机制的能力(30)。然而，这些方法通常不能区分病毒传播动力学的所有竞争假说(16)。我们展示了使用空间复制、纵向基因组学的数据丰富的方法如何提供更高的分辨率，揭示宿主内和宿主间的机制，使病毒能够在野生种群中长期维持。我们发现DrBHV经历了与其他β疱疹病毒相似的潜伏期和再活化的终生循环(32， 42， 43)。令人兴奋的是，这种复发能力可能会产生一种自我加强的疫苗，在受感染宿主的一生中零星传播，例如，无需额外的部署工作就可以对未来的出生队列进行免疫接种。我们还发现，相对于其他β疱疹病毒，DrBHV的活跃期和潜伏期的相对长度是相反的，估计DrBHV处于活跃状态的时间比处于潜伏期的时间长。相对于其他β疱疹病毒，这种宿主内生物学改变的原因尚不清楚，但可能反映了蝙蝠免疫相对于其他宿主分类群或过程的差异，这些差异被所研究模型的简单性所掩盖，如宿主之间的异质性(44， 45)。无论如何，延长的活跃感染期将有利于针对狂犬病的免疫增强，因为基因插入抗原的延长表达，对于该系统，狂犬病糖蛋白(46)。我们的模型选择也意味着使用我们目前的测序方法和样本类型，在感染的潜伏阶段检测不到DrBHV。这一发现表明在未来的疫苗丢失实验中需要注意，并表明流行率可能在现场研究中被低估。重要的是，我们的结论通过显式建模潜伏期和可检测性，自然地整合了这种不确定性，说明了解释现场数据的机械模型的价值。

与常规疫苗相比，可传播疫苗的一个主要优势是理论上能够在人群中达到平衡覆盖率，从而能够针对单次疫苗释放提供长期保护。尽管我们表明在平衡状态下DrBHV可能对狂犬病有重大影响(图4)，在宿主一生中传播的低传染性意味着疫苗平衡实现缓慢(> 12年)，并会受到人群中对预先存在的野生型DrBHV的交叉免疫和逆转的进一步阻碍，(图3和6)。对后一个结论的一个重要警告是，我们模拟了个体宿主的完全逆转，即个体中所有携带抗原的病毒体的丢失，在这种逆转率(η = 1)下，相当于每年所有接种过疫苗的蝙蝠的疫苗丢失。除非疫苗的抗原性货物对载体病毒的复制造成严重损害，否则在这一时间范围内，在个体中完全丧失疫苗似乎是不可能的。而插入序列在传代过程中从细胞培养物中的病毒体中丢失(31， 47)，考虑到不同组织内病毒区室化的可能性、潜伏期的保护作用和选择压力的差异，这一过程在整个生物体的水平上可能较慢。通过选择合适的区域将抗原插入载体基因组来维持疫苗的适应性并降低由于疫苗抗原的存在而增加的宿主免疫力将是需要考虑的重要问题。然而，什么构成了“现实的”逆转率还不确定，我们的结果强调了需要长期的体内研究来确定导致逆转率的宿主和病毒因素(17)。

尽管疫苗传播的平衡维持对部分交叉免疫是强有力的，但是交叉免疫和逆转的组合效应损害了疫苗的平衡覆盖。重要的是，接种更高比例的蝙蝠种群可以缓解这两个问题，这可以通过主动或被动的疫苗部署策略来实现。首先，较高的夜间捕获率将使得能够以相对较低的努力对大部分蝙蝠种群进行直接接种(5)。第二，如果口服疫苗感染可能发生，这将为使用局部应用的载有疫苗的可转移凝胶开辟前景，这种凝胶通过同种异体修饰在蝙蝠之间传播。这种策略已经被用于毒杀吸血蝙蝠以控制种群数量(48， 49)和在野外环境中对17%至50%暴露的蝙蝠和57.5%至89.9%未处理的蝙蝠试验性应用含有荧光生物标记的局部凝胶(5)。以某种程度的逆转为特征的可传播疫苗的可转移部署可能是期望的，以实现高的初始覆盖率和延长疫苗保护，同时防止无限期的疫苗循环，这被推测为引入围绕潜在突变的未知风险和较长时期内宿主范围的变化(10)。

我们的模拟显示了DrBHV载体疫苗成为降低VBRV的人类健康和经济负担的有效和低成本途径的潜力。重要的是，我们的预测可能低估了狂犬病控制的真实效果，这可能是出于几个原因。首先，我们建立了一个保守的流行病学模型，集中于以前没有暴露于狂犬病的蝙蝠群体。这种情况与经历病毒入侵的区域相关；然而，大多数疫苗接种将针对狂犬病流行的蝙蝠种群，其中通过免疫狂犬病暴露对VBRV的大量保护性免疫水平将增强疫苗诱导的免疫(16， 50)。第二，相对较低的R0VBRV的存在及其对长期维持的菌落间传播的依赖性意味着它自然存在于灭绝阈值(16， 51)。因此，对关键群体进行疫苗接种不仅可以降低该接种蝙蝠群体中狂犬病爆发指标，还可以在群体间水平上引发VBRV灭绝。VBRV的空间动态也意味着最佳疫苗接种策略将依赖于环境。例如，我们的结果表明，假设交叉免疫水平较低，如果预计未来4年内不会发生疫情(例如，狂犬病入侵率较低的地区)，则没有必要接种超过15%的蝙蝠。最终，需要开发狂犬病传播的空间直观模型，以确定可作为战略目标的蝙蝠种群，并了解可传播疫苗释放的群体间结果(50)。此外，我们无法在此评估DrBHV传播的潜在重要复杂性，包括年龄结构(42)，DrBHV的垂直传输(52， 53)，应该在圈养蝙蝠中调查个体异质性。最后，一旦DrBHV载体狂犬病疫苗可用，这项研究基于模型的结论应通过实验证实。我们的敏感性分析指出，疫苗传播率、交叉免疫水平和疫苗效力是实验研究的重点。最后，在向任何自然人群释放疫苗之前，还必须在适当的监管框架内进行和评估大量的安全性和有效性检查(例如，宿主特异性和无临床疾病以及无T细胞耗竭)。

通过整合纵向现场数据研究、基因组技术和建模，我们推断出一种新发现的病毒在野生宿主中的传播生物学，而不依赖于实验感染或从更好表征的宿主-病毒系统中借用数据。我们的数据驱动模型提供了迄今为止对目标系统中可传播疫苗动态的最符合生物学的预测，并证明了利用DrBHV在吸血蝙蝠中防治狂犬病的可行性，从而防止其蔓延到其他物种。还没有在野生动物中部署可传播的疫苗来防止传播给人类或家畜。我们的结果为优化用于对抗人畜共患病的可传播疫苗的部署所需的数据设定了一个令人鼓舞的基准。

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v2 Deposited 11 January 2023.