巴斯德对疫苗历史的贡献

Maxime Schwartz

疫苗接种，即牛的一种良性疾病“疫苗”的传播，使人类对天花免疫，是詹纳在十八世纪末发明的。巴斯德确信疫苗微生物是天花微生物的一种减毒形式，他表明，同样地，对动物疾病免疫的其他微生物的减毒形式。当将这一原理应用于狂犬病时，他意识到，在这种情况下，疫苗实际上是由死亡的微生物组成的。他的一个学生立即利用这一结果设计了一种伤寒疫苗。1921年，白喉和破伤风疫苗开辟了一条新的途径，即利用病原微生物的分子进行免疫接种。然后，分子生物学允许微生物(如酵母)产生免疫原性分子，或通过转基因病毒或信使RNA诱导我们自己的细胞产生这些分子进行免疫。

自2019年底新冠肺炎疫情出现以来，疫苗的话题就一直挂在每个人的嘴边。因此，也许有必要回顾一下人类发现的抗击传染病的最有效武器之一的历史。今年，当我们庆祝巴斯德诞生200周年时，这是一个机会来回顾他和他的学生或巴斯德研究所的继任者在这段历史中发挥的重要作用。

1.变异和疫苗接种(1796年)

疫苗接种的概念起源于一个可以追溯到古代的观察，即被某些流行病感染过一次的人一般不会被感染第二次。

至少自16世纪以来，也许自11世纪以来，中国人利用这一观察来保护儿童免受天花的感染，天花是一种极其常见的流行病，它导致皮肤上出现脓包，并造成大量受害者。他们进行了变异，包括从患有轻度疾病的患者的脓疱中提取材料，并以各种方式给健康儿童接种。这些儿童通常会感染轻度天花，但在后来的流行病中受到保护。

这种习俗在18世纪早期由英国驻君士坦丁堡大使的妻子玛丽·蒙塔古女士引入欧洲，尤其是英格兰。虽然有效，但这种做法非常危险，导致死亡的频率估计在0.5%到2%之间。

就在那时，在18世纪末，一个英国乡村医生，爱德华·詹纳，对变异作出了相当大的改进。他注意到一种良性的牛病，牛痘，类似于天花，导致乳房上出现脓包。感染这种良性疾病的女牛仔，手臂上出现一些脓包，在天花流行期间受到保护。然后他有了将牛痘从一个受感染的女牛仔身上传染给一个孩子，然后给这个孩子接种天花的想法。这个孩子没有感染这种疾病。这种操作后来被命名为疫苗接种，多年来这种操作得到了改进，特别是直接从母牛身上提取疫苗浆。由于世卫组织领导的一场国际运动，这种疾病的推广导致了1980年在世界范围内根除了这种疾病（1）。

2.巴斯德的第一批疫苗:鸡霍乱(1879年)和炭疽(1881年)

詹纳的发现是基于动物中存在一种良性疾病，这种疾病接近于一种非常危险的人类疾病。这是一种特殊情况。此外，詹纳并不知道传染原导致了天花和牛痘。一个世纪后的巴斯德却不是这样。

巴斯德认为这两种疾病都是微生物引起的，牛痘可能是天花的一种减毒形式。然后他想知道其他微生物的减毒形式是否也能预防它们引起的疾病。

1879-1880年，他在鸡霍乱方面取得了第一次成功，这在一定程度上是偶然的，鸡霍乱是家禽养殖场的一种常见疾病2。他证明了通过让导致这种疾病的细菌的年龄培养，现在被称为多杀巴氏杆菌，细菌失去了毒性并被减毒。当他将这些减毒的细菌注射到鸡体内时，它们就能抵御致命细菌的攻击。

然后他攻击了羊和牛的炭疽热。这种疾病正在摧毁法国和其他欧洲国家的畜牧场。他已经对这种疾病感兴趣，因为在法国人卡西米尔·达维因和德国人罗伯特·科赫的工作之后，他已经证实了这种疾病是由一种特殊的细菌引起的，炭疽杆菌 [3]。这是首次证明传染病是由微生物引起的。在炭疽的情况下，巴斯德表明，就像鸡霍乱的情况一样，有可能获得一种减毒的致病细菌，并且接种这种细菌可以防止烈性细菌。在持怀疑态度的兽医的要求下，他于1881年6月在Pouilly-le-Fort的塞纳-马恩省的一个农场进行了演示4。五十只羊交由他支配。其中25只羊接种了减毒细菌，几周后，50只羊接种了强毒细菌。只有那些先前接种了减毒细菌的存活了下来。这一经历使大部分法国人相信了他的疫苗理论的正确性。

剩下的是改变世界的其余部分。1881年8月，在伦敦举行的国际医学大会上，他得到了这样做的机会。在这次大会期间，他宣布[5]:“我已经给了疫苗接种的表达一个扩展，我希望，科学将神圣的一个英格兰最伟大的人之一，你的詹纳的优点和巨大的服务。”

巴斯德由此表明，只要有可能削弱致病微生物，使其失去毒性，就有可能通过使用致病微生物接种疫苗来预防疾病。这是一种获得疫苗的方法。所以有时候会说，如果詹纳发明了疫苗接种，巴斯德就发明了疫苗。

当巴斯德在Pouilly-le-Fort接种疫苗时，他不知道细菌被减毒的机制。直到一个世纪后，才发现这种细菌的减毒是由于负责其毒力的两种质粒之一的缺失所致6。应该顺便指出，巴斯德是非常幸运的，因为质粒的丢失是非常偶然的，在Pouilly-le Fort使用的细菌要么两个质粒都没有丢失，在这种情况下，25只接种过疫苗的羊可能会很快死亡，要么它们可能两个质粒都丢失了，由于减毒太厉害，它们不会进行免疫，25只本应接种过疫苗的羊在被注射有毒细菌后会像其他羊一样死亡！如今，为了在流行病的情况下给牲畜接种疫苗，可以获得失去一种质粒的菌株，并且不再需要每次都进行强毒菌株的减毒7。

3.狂犬病(1885年)

尽管炭疽疫苗的成功产生了相当大的影响，许多人，尤其是医生，继续质疑巴斯德的理论。为了说服他们，必须解决影响人类的疾病。巴斯德选择了狂犬病，它主要影响犬和狼，但也可能影响被患有狂犬病的动物咬伤的人。即使这种疾病在法国并不常见，但它会传播恐怖。阿斯·米勒·杜克洛8是巴斯德的信徒，他回忆道，“狂犬病让人们难以想象。它让人想起传说中的景象，愤怒的病人，让他们周围的人感到恐惧，被绑起来尖叫，或者在两个床垫之间窒息。”对巴斯德来说，战胜这种疾病是确保说服医生相信他的理论的有效性。

在寻找狂犬病疫苗的过程中，巴斯德遇到了巨大的困难，正如我们现在所知，这是因为狂犬病的“微生物”不是细菌，不像鸡霍乱或炭疽的微生物，而是一种病毒。他不能在光学显微镜下看到它，也不能培养它，就像他对鸡霍乱和炭疽细菌所做的那样。

然而，巴斯德设法通过在动物之间传播来“培养”病毒。为了做到这一点，他利用了1879年医生Paul-Henri Duboué的观察，即病毒位于神经系统、大脑和脊髓中。他还利用了兽医Pierre Victor Galtier的观察，即狂犬病可以传染给兔子，兔子是一种比犬危险得多的动物。他通过将死于狂犬病的兔子的脊髓样本接种到健康兔子的大脑中来维持他的病毒。通过将他的病毒从一只兔子身上转移到另一只兔子身上，他获得了一种他称之为“固定”的病毒，这种病毒有一个相对较短的潜伏期，总是一样的，大约一周。这些兔子的脊髓成了病毒的来源。在不知情的情况下，巴斯德成为了第一个病毒学家！

仍然有削弱这种病毒的方法。为了做到这一点，他着手在干燥的空气中干燥患狂犬病的兔子的脊髓，并发现毒性，正如他所希望的那样，逐渐减弱，减毒脊髓的接种使犬对非减毒脊髓免疫(图1)。这些试验表明，大约15天后获得了免疫力。由于被患狂犬病的犬咬伤的人感染狂犬病通常需要更长的时间，巴斯德认为，通过在咬伤后迅速接种疫苗，在病毒有时间扩散到大脑之前建立免疫力是可能的。我们都知道他是如何在1885年7月6日第一次为一个人接种疫苗的，这个人就是9岁的阿尔萨斯小男孩约瑟夫·梅斯特，他被一只患狂犬病的犬严重咬伤9。为了做到这一点，就像对犬一样，他使用了一种有点出人意料的方法，类似于mithridatization，这是一种古老的程序，旨在通过让人们吸收越来越多的剂量来使他们对毒药产生抗药性。他首先接种了已经干燥了14天的脊髓，因此完全没有毒性，然后接种了干燥时间越来越短的脊髓，最终得到了完全有毒性的脊髓。约瑟夫·梅斯特没有得狂犬病，在接下来的8个月里，在巴斯德实验室被咬伤并接受治疗的大约350人也没有。鉴于这一惊人的结果，科学院发起了国际认购，允许巴斯德研究所的建设。

图1.

巴斯德在高等师范学院的实验室里。它展示了巴斯德拿着一个烧瓶，烧瓶中悬挂着一只死于狂犬病的兔子的脊髓。

从科学上讲，最重要的，但最不为人知的，接种狂犬病疫苗的后果如下。虽然巴斯德最初认为他的疫苗将由减毒活病毒制成，就像鸡霍乱和炭疽一样，但他得出的结论是，他所认为的在脊髓干燥过程中病毒的减毒实际上是对病毒的破坏。他得出结论，诱导免疫的不是减毒活病毒，而是一种与病毒有关的“接种物质”,可能杀死了病毒10。从理论的角度来看，这完全改变了他对诱导免疫的想法。最初，巴斯德认为宿主中的减毒微生物是同种微生物发展的必要成分，因此也是毒性形式的微生物。如果用杀死的微生物获得免疫，这种解释就不再成立。在实践层面上，这为由灭活微生物组成的疫苗开辟了道路，仅次于减毒活疫苗。

与此同时，美国人丹尼尔·萨蒙和西奥博尔德·史密斯证明了杀死细菌的动物可以产生抗沙门氏菌的免疫力11。

基于被杀死的微生物的疫苗的第一个例子，并且广泛传播，是针对伤寒的疫苗。

4.伤寒(1888-1914)(22)

19世纪末，伤寒，由一种叫做伤寒沙门氏菌是一种广泛传播且经常致命的疾病。污染通常是由于摄入了被病人粪便污染的水或食物。这种疾病夺去了巴斯德的两个女儿的生命，并在1870年战争中差点杀死了他的儿子。

巴斯德的合作者之一安德烈·尚特梅塞(André Chantemesse)一加入巴斯德的实验室就对伤寒产生了兴趣，并立即开始研制疫苗。鉴于巴斯德在狂犬病疫苗的结论，可能是鲑鱼和史密斯在另一个沙门氏菌他决定尝试用加热杀死的微生物来免疫动物。在这方面，他的学生Fernand Widal协助他。这是一个成功，体现在1888年和1892年发表的两篇文章中12, 13。

在这项开创性的工作之后，英国和德国进行了进一步的研究以改进疫苗[14, 15, 16]。这两个国家的研究人员在1896-1897年进行了第一次人体试验。取得的成功，尤其是英国人取得的成功，促使法国人考虑给部队接种疫苗，因为人们知道这种疾病在冲突期间容易发生。在这一点上，另一个主要角色介入了，他就是陆军卫生服务局的医生海辛·文森特。Val-de-grce的教授Vincent很快理解了接种疫苗预防这种疾病对军队的好处。他先在豚鼠身上做了实验，然后在他自己和他的学生身上做了实验，说服军事当局在军队中实施这种疫苗接种。

1914年初，一位名叫莱昂·拉贝的参议员提出了一项法案，要求在整个法国军队中强制接种抗伤寒疫苗。该法律于3月28日通过。疫苗的生产和销售委托给了Val-de-gr ace的陆军和巴斯德研究所的海军。

第二年八月，宣战了。从冲突一开始，伤寒就肆虐。受影响的士兵永远无法行动，死亡率为百分之十二。面对这种必然会蔓延的流行病，迫切需要适用拉韦法律。从10月起，对年轻新兵进行了系统的疫苗接种。

很快就清楚了接种疫苗伤寒沙门氏菌单独使用不足以预防伤寒。的确，副伤寒沙门菌与这种细菌非常接近的a和B引起一种与真正的伤寒几乎相同的疾病。这些细菌虽然关系密切，但差异很大，对一种细菌的免疫不能保护其他细菌。因此，针对这两种副伤寒的疫苗接种与针对伤寒本身的疫苗接种相结合。这是从1916年开始给军队接种的结核疫苗。后来，抗白喉和抗破伤风效价被添加到这种疫苗中，因此成为著名的TABDT疫苗，所有服过兵役的人都记得它，因为它有相当令人不快的副作用！

系统的疫苗接种运动取得了巨大的成功。结果是惊人的:1914年底，军队中的患病人数约为每月9000例，而1917年仅为130例。据估计，疫苗接种在战争期间保护了约100万名士兵免于患病，并防止了15万人死亡17。

5.白喉和破伤风:血清疗法(1894年)和疫苗(1923年)

在巴斯德的时代，白喉是儿童死亡的主要原因。在法国，成千上万的儿童死于可怕的痛苦，因喉咙中形成的假膜而窒息。在1888-1889年，巴斯德人埃米勒·鲁和亚历山大·耶尔森表明，这种细菌分泌一种毒素，这种毒素引起了这种疾病的所有症状18。两年后，丹麦医生Knud Faber发现破伤风细菌也是如此，破伤风是一种可怕的疾病，可由深而脏的伤口引起19。同年，也就是1890年，埃米尔·贝林和柴田北里在柏林罗伯特·科赫的实验室里，有了一项重大发现。给豚鼠注射用碘化合物(碘仿、三氯化碘)部分灭活的白喉或破伤风毒素，可保护它们免受注射相应杆菌引起的疾病。此外，这些免疫动物的血液中含有抗毒素20。这是由抗体组成的，这一点我们以后会知道。

德国的贝林集团和法国的鲁集团随后进行了临床试验，以观察注射免疫动物(在这种情况下是马)的血清是否能拯救患白喉的儿童。在1894年，两组都取得了相同的结果:接受所谓“血清疗法”治疗的儿童存活率为75%,而未接受治疗的儿童存活率仅为40 %[21]。后来治疗方法的改进使血清疗法后的存活率提高到90%。至于抗破伤风血清疗法，由于巴斯德研究所制备的血清，至今仍用于治疗深度伤口，在第一次世界大战的战场上挽救了数百万人的生命。让我们补充一点，通过单克隆抗体的发展，血清疗法最近经历了显著的复兴。

但是为什么不像在豚鼠身上所做的那样，将部分灭活的毒素直接注射到儿童体内，使他们获得预防性免疫呢？原因是毒素不能被充分灭活以使其无风险而不丧失其免疫能力。

巴斯德的加斯顿·拉蒙在20世纪20年代解决了这个问题。他发现用福尔马林处理毒素会使其完全失活，而不会导致其丧失诱导免疫的能力22。这种灭活毒素后来成为白喉疫苗的基本成分，这种疫苗至今仍在使用，由于这种疫苗，白喉已经从工业化国家消失了。破伤风疫苗接种史与白喉疫苗接种史相似。由于这种疫苗，破伤风病例在我们这些国家变得异常罕见。英国免疫学家亚历山大·格伦尼和芭芭拉·霍普金斯同时进行了与拉蒙相似的工作23。

白喉和破伤风疫苗是第一批既不是由减毒活菌也不是由灭活菌制成的疫苗，而是由致病微生物的分子(减毒毒素)制成的疫苗。

值得注意的是，拉蒙不仅发明了白喉和破伤风疫苗。他还发现了佐剂的作用，即那些能大大提高疫苗接种效果的化合物24。他使用的佐剂是对组织有“刺激性”的物质。这些包括:琼脂，木薯淀粉，玉米油，鸡蛋卵磷脂和皂甙。然而，不久之后，在1926年，英国和德国的研究人员用氢氧化铝获得了优越的结果，此后氢氧化铝被广泛使用。

在提到历史上的疫苗时，我们不能不提到结核病疫苗。

6.肺结核(1921年)

纵观历史，在整个世界，这种疾病一直是人类的巨大祸害之一。在法国，20世纪初，它被称为“大杀手”，每年造成约15万人死亡。罗伯特·科赫在1882年发现了这种细菌25。因此命名为“科赫氏杆菌”，它仍然经常与其学名一起使用，结核分枝杆菌.

巴斯德在这一领域的重大发现是针对这种疾病的疫苗，这种疫苗一部分由里尔巴斯德研究所制造，一部分由巴黎巴斯德研究所制造。这是医生艾伯特·卡尔梅特和兽医卡米尔·盖林的工作成果，前者是巴斯德的助手之一，后者是卡尔梅特于1897年在里尔的巴斯德研究所聘用的。

1900年，他们开始寻找同样影响人类的牛结核杆菌的减毒变种。他们在浸有牛胆汁和甘油(牛胆汁可以防止细菌聚集)的马铃薯切片上培养这种杆菌。每三周，少量繁殖的细菌被移植到新的马铃薯切片上。经过231次连续移植和13年的努力，卡尔梅特和古林在1921年获得了一种细菌培养物，这种细菌培养物不再引起结核病，但诱导了新生儿对这种疾病的保护性免疫26。这就是卡介苗，在很长一段时间里，它是世界上使用最广泛的疫苗。

由于卡介苗，也由于抗生素的使用和卫生条件的改善，结核病在发达国家已经变得罕见(法国每年约5000例，数百例死亡，而20世纪初的死亡人数为15万。然而，它继续在发展中国家每年杀死大约150万人。

7.疫苗和分子生物学(1980-2020)

在这一阶段，疫苗可分为三大类:基于减毒活微生物、灭活微生物或来自微生物的分子，可称为“亚单位”或“分子”疫苗(表1).后者是疫苗行业的圣杯，因为它们比其他药物定义更明确，而且不容易产生副作用。对于这些亚单位疫苗，有时可以从微生物中化学合成分子的类似物，这确保了更高的纯度。

表1三种疫苗的例子

最后，我们将看看近年来分子生物学在新疫苗开发中所起的作用，包括针对新冠肺炎的疫苗。

分子生物学(基因工程)在设计人类使用的疫苗中的第一次成功应用是在乙型肝炎疫苗的制备中。乙型肝炎是一个世界性的问题。在20世纪80年代末，估计约有20亿人感染了这种病毒，其中3 . 5亿人患有慢性肝炎，每年有60万人死于这种病毒。此外，慢性感染可导致原发性肝癌。所有寻找疫苗的传统方法都被证明是不切实际的，因为不可能在体外培养病毒。

在20世纪80年代中期，巴斯德研究所的皮埃尔·蒂奥莱伊斯团队开始着手一项当时非常创新的方法。在与当时圣路易斯医院的药剂师和分子生物学家Francis Galibert小组的合作中，他们首次克隆并测序了这种病毒的基因组。然后将编码病毒包膜蛋白的基因引入动物细胞，动物细胞开始连续分泌空病毒颗粒。这些构成了1989年投放市场的疫苗的基础[27, 28]。此后不久，美国也采用了类似的方法，用酵母代替动物细胞。后者更容易获得且更便宜，最终取代了法国疫苗。Novavax和Sanofi Pasteur今年发布的COVID疫苗属于同一类基因工程病毒蛋白。

寻找活疫苗的现代方法是使用重组微生物。在这种情况下，来自病原微生物的基因被引入到非病原微生物的基因构成中。这种重组微生物可能诱导针对所述病原微生物的免疫。因此，在20世纪80年代后期，通过将狂犬病病毒包膜基因引入痘苗病毒中，构建了兽用狂犬病疫苗[29]。这种疫苗混合在分布于森林和田野的诱饵中，有助于我国狂犬病的消失，直到几年前，狂犬病还在狐狸和其他野生动物中流行。巴斯德研究所也尝试使用重组微生物来寻找对抗新冠肺炎的疫苗，尽管没有成功。在这种情况下，病毒刺突蛋白的基因(S基因)被引入减毒麻疹病毒中，减毒麻疹病毒长期以来被大规模用作针对这种疾病的疫苗。在阿斯利康和让桑疫苗中成功使用了类似的方法。在这些情况下，冠状病毒S基因被引入腺病毒，这与以前的疫苗(狂犬病和麻疹)不同，是一种无法复制的简单载体。

最后，让我们来看看信使RNA疫苗。信使RNA是1961年在巴斯德研究所发现的。当弗朗索瓦·雅各布和贾克·莫诺提出著名的细菌基因表达调控的操纵子模型时，它的存在就被假定了30。在接下来的几个月里，弗朗索瓦·雅各布和弗朗索瓦·格罗分别发现了这种物质，他们当时在美国实验室呆了几个月31, 32。当时没有人有用这种信使RNA做疫苗的想法，原因有几个。一个是这种分子的极端不稳定性。另一个原因是，没有人在寻找新的疫苗形式，因为现有的疫苗相当令人满意。

直到20世纪90年代，随着分子生物学的发展和艾滋病等新疾病的出现，使用DNA和信使RNA作为疫苗的想法才开始出现。两种情况下的目的都是让接种者的细胞自己产生疫苗蛋白。到目前为止，DNA的成功令人失望。另一方面，用信使RNA已经成功地控制了新冠肺炎疫情[33]。一方面，这需要找到稳定RNA的方法，使其对核糖核酸酶和免疫反应具有抗性，另一方面，将这种RNA插入脂质微粒中，使其渗透到细胞中。

8.结论

在疫苗发现的历史中，其作用机制的问题被搁置一旁。这是免疫学的领域，一门精确地从疫苗工作中诞生的学科，但它不再局限于研究针对感染因子的保护，还涉及许多其他领域，如自身免疫性疾病、移植排斥、过敏或癌症。

这篇文章强调了巴斯德对疫苗概念的发现和其中一些疫苗的发展所做贡献的重要性。通过消除像天花、肺结核、白喉或脊髓灰质炎这样致命的传染病的幽灵，特别是在发达国家，疫苗成为延长人类预期寿命的主要因素。

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