金纳米颗粒和明矾作为狂犬病疫苗佐剂的比较研究

Rehab Essam El-Din El-Hennamy

摘要

目的

本研究旨在比较金纳米粒子(AuNPs)和明矾对狂犬病疫苗的免疫增强潜力以及相关的免疫、生理和组织病理学效应。

材料和方法

明矾和AuNPs 与狂犬病疫苗的组合分别以0.35mg/ml和40nm/ml使用。将所用大鼠分为六组(每组20只):对照大鼠、狂犬病疫苗、明矾、吸附于明矾的狂犬病疫苗、AuNPs和狂犬病疫苗佐剂AuNPs。

结果

与对照组相比，接种AuNPs和明矾佐剂疫苗后，肝脏和肾脏功能在正常范围内。在用明矾和AuNP佐剂疫苗免疫的组中，白细胞介素-6和干扰素-γ水平显著升高，在AuNP佐剂疫苗的情况下，在第14天达到峰值水平。接种后90天，与未加佐剂的疫苗相比，加佐剂的狂犬病疫苗的总免疫球蛋白G (IgG)显示出显著升高的抗狂犬病IgG。总抗氧化能力、丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性在佐剂AuNPs佐剂疫苗接种后比在明矾吸附疫苗中显著增加，而MDA显著降低。组织病理学检查显示，与未佐剂和未免疫组给药后的肝和肾特征相比，AuNPs和明矾佐剂疫苗免疫后可检测到变化，同时，脾组织显示淋巴滤泡增生，表明免疫反应性增加。

结论

AuNPs与明矾一样是有希望的免疫反应增强剂，并且AuNPs的不良作用可以通过使用合适的尺寸、形状和浓度来控制。

关键词:狂犬病; 疫苗; 金纳米粒子; 明矾; 干扰素类; 白细胞介素6; 病理; 生理学

狂犬病是一种可预防的人畜共患疾病，会导致急性脑炎。在资源有限和资源贫乏的国家，地方性狂犬病犬由于它们的叮咬而导致传播给人类的持续风险。对非洲和亚洲的大部分地区来说，通过控制患有狂犬病的家犬来预防人类狂犬病是一个现实的目标。建议前往受狂犬病影响国家的高风险地区的旅行者，以及从事某些高风险职业的人，如处理活狂犬病病毒和其他狂犬病相关病毒的实验室工作人员，以及受狂犬病影响地区的兽医和动物饲养员进行接触前免疫接种。

明矾佐剂仍然是唯一被批准用于人类的佐剂。铝化合物被用作免疫佐剂以增加许多疫苗的效力。在某些情况下，这些化合物与发红、瘙痒和低烧有关，但它们在疫苗中的使用与严重不良事件无关。疫苗生产的质量可以通过将免疫调节剂或佐剂与改良的递送载体结合来提高。除明矾外，脂质体、免疫刺激复合物和微米/纳米球被用作金标准。

纳米粒子，特别是金属纳米粒子的使用已经扩展到生物医学研究、诊断、治疗化妆品、电子、创新食品和环境修复中。由于它们具有小尺寸、大表面积/体积比、对活细胞的高反应性、高温稳定性和向细胞内转移的独特性质，它们被用于各种领域。由于它们能够与周围环境中的其他纳米粒子反应并聚集，因此它们具有不同的尺寸和形状。据报道，金纳米粒子(AuNPs)是惰性的，细胞毒性相对较小。金被用于各种应用，包括药物和基因输送，表明该领域的巨大发展[3].本研究旨在研究AuNPs作为明矾替代佐剂的用途，并找出相关的生物学变化，包括肝脏和肾脏功能、体液和细胞免疫；总免疫球蛋白G (IgG)、白细胞介素-6 (IL-6)和干扰素-γ(IFN-γ)。此外，还考虑了肝、肾和脾的组织病理学变化。

疫苗效力

Vero细胞狂犬病疫苗有效剂量50 (ED₅₀）、效价为4.5 IU/mL，符合世界卫生组织推荐的有效疫苗效价50不低于2.5国际单位/剂量。

肝功能评估

如所示图1、明矾和AuNPs作为佐剂单独使用或与Vero细胞狂犬病疫苗联合使用时，显示出不同水平的肝功能ALT和AST值。虽然检测到了变异，但与未接种疫苗的对照组相比，这些值在正常范围内。在施用Vero细胞狂犬病疫苗、明矾和AuNPs后的第3天，ALT变化的百分比与未接种疫苗的对照组值相比是显著的(p<0.05)，分别记录了20.83%、17.26%和20.83%的百分比差异；而在第7天，只有AuNPs组显示出15.68%的增加，其显著变化为p<0.05。在用明矾-Vero细胞狂犬病疫苗接种后的第3、7和14天，ALT水平显示分别增加20.24%、15.68%和16.04%，并且在用AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗免疫的情况下，记录的变化分别为22.62%、17.30%和18.72%，与对照相比p<0.05有显著变化。与单独疫苗免疫组的ALT水平相比，明矾-Vero细胞狂犬病疫苗和AuNP-Vero细胞狂犬病疫苗佐剂组均显示在免疫第14天ALT水平显著(p<0.05)增加。

图1. (A–I)在接种后第3、7和14天，用明矾、金纳米粒子(AuNPs)溶胶或狂犬病疫苗佐剂免疫的成年雄性大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP)活性(U/L)的比较评估。答与对照组相比有显著变化(p<0.05)。b)与疫苗(Vac)组相比有显著变化(p<0.05)。c)与明矾组相比有显著变化(p<0.05)。d)与AuNPs组相比有显著变化(p<0.05)。

天冬氨酸转氨酶活性的评估

如所示图1与对照组AST值相比，在第3、7和14天收集的大鼠血清显示出AST活性的显著变化(p<0.05)，在施用狂犬病疫苗后AST活性依次为27.60%、28.30%和51.90%，施用明矾后AST活性依次为43.52%、43.62%和51.90%，施用AuNPs后AST活性依次为55.41%、54.89%和64.43%。此外，记录的数据显示，在第3、7和14天的AST水平显著改变(p<0.05)，在施用明矾-Vero细胞狂犬病疫苗后分别记录45.44%、52.55%和61.97%，并且与对照AST值相比，在施用AuNP-Vero细胞狂犬病疫苗后AST增加水平分别为57.32%、53.40%和61.07%。

碱性磷酸酶活性的估计

如所示图1对从不同大鼠组收集的关于ALP活性的数据的分析显示，在单独施用疫苗后的第3天和第7天，ALP活性显著(p<0.05)升高，与对照值相比，分别记录了19.63%和15.61%。同时，与对照组值相比，单独施用明矾和AuNP显示了明矾和AuNP后分别记录(18.16%、21.62%和12.97%)和(20.74%、23.00%和13.75%)的显著变化(p<0.05)。相反，在第14天没有检测到变化。同时，与对照组值相比，明矾-Vero细胞狂犬病疫苗和AuNPs佐剂狂犬病疫苗在用明矾-Vero细胞狂犬病疫苗免疫后第3、7和14天在AuNPs中ALP水平记录(33.25%、33.02%和11.23%)和(40.86%、24.26%和23.04%)中分别显示显著变化(p<0.05)。同时，与单独疫苗免疫组的水平相比，Alum-Vero细胞狂犬病疫苗在接种的第7天显示出ALP水平的显著增加，而用AuNP-Vero细胞狂犬病疫苗免疫在第3天和第14天显示出与同一组相同的效果。

肾功能评估

单独施用狂犬病疫苗和明矾，在第3天、第7天和第14天的尿素水平与其在对照组中的水平以及肾功能水平的边界水平相比出现正常变化，相反，施用AuNPs和AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗后尿素水平显著升高，如所示图2；记录(42.38%、55.76%和54.14%)、(38.49%、59.93%和56.07%)、(53.15%、66.79%和60.39%)、(57.96%、63.97%和52.78%)和(60.94%、69.36%和64.47%)单独疫苗、明矾、明矾-Vero细胞狂犬病疫苗、AuNPs和AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗免疫在免疫第3天，AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗免疫组的尿素水平比单独疫苗免疫组显著增加(p<0.05)。

图2. (A–F)在接种后第3、7和14天，比较评估用明矾、金纳米粒子(AuNPs)溶胶或狂犬病疫苗佐剂免疫的成年雄性大鼠血清中的尿素和肌酸酐水平(mg/dL)。答与对照组相比有显著变化(p<0.05)。b)与疫苗(Vac)组相比有显著变化(p<0.05)。c)与明矾组相比有显著变化(p<0.05)。d)与AuNPs组相比有显著变化(p<0.05)。e)与明矾-真空组相比有显著变化(p<0.05)。

如所示图2单一疫苗、单一佐剂和有佐剂疫苗给药后的血清肌酸酐水平显示出非病理性变化，并且记录的值在规定的持续时间内处于肾功能的正常范围内。

白细胞介素-6水平

如所示图3与对照组值相比，在单独施用狂犬病疫苗后的第3天，诱导了降低的IL-6水平(-8.74%)，随后在接种后的第7天和第14天分别显著(p>0.05)增加了水平(78.79%和270.87%)。与对照组值相比，单独施用明矾和AuNPs在第3、7和14天分别诱导显著(p<0.05)升高的IL-6水平(12.94%、19.00%和5.55%)和(27.74%、-25.39%和-14.39%)。很可能，在第3、7和14天，与对照组、单独的Vero细胞狂犬病疫苗、明矾和AuNPs组相比，明矾-Vero细胞狂犬病疫苗和AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗免疫组诱导了IL-6水平的显著(p<0.05)升高。此外，与用AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗免疫后的IL-6水平相比，明矾-Vero细胞狂犬病疫苗组显示IL-6水平显著升高(p<0.05)。

图3. (A–F)在接种疫苗后的第3、7和14天，用明矾、金纳米粒子(AuNPs)溶胶或狂犬病疫苗佐剂免疫的成年雄性大鼠血清中白细胞介素-6 (IL-6)和干扰素-γ (IFN-γ)水平(pg/mL)的比较评估。答与对照组相比有显著变化(p<0.05)。b)与疫苗(Vac)组相比有显著变化(p<0.05)。c)与明矾组相比有显著变化(p<0.05)。d)与AuNPs组相比有显著变化(p<0.05)。e)与明矾-真空组相比有显著变化(p<0.05)。

干扰素-γ水平

在接种疫苗后的不同时间间隔，所有组大鼠血清中的INF-γ水平均显示出显著的(p<0.05)增加，并且在施用AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗组后观察到最高的增加，如在中清楚证明的图3。记录的INF-γ水平的增加是(15.13%、147.58%和375.81%)、(36.31%、15.84%和31.59%)、(65.40%、160.26%和292.34%)以及(81.04%、198.61%和307.26%)和(119.71%、219.02%和471.14%)单独疫苗

免疫球蛋白G水平

关于制备的狂犬病疫苗的免疫潜力，数据见图4显示了在接种后90天监测的灭活狂犬病疫苗的免疫原性。与对照值相比，抗体IgG水平显示出111.96%的升高，具有p<0.05的显著变化。在明矾组或AuNPs组中均记录到免疫反应性的正增强，与对照组相比，其值分别为79.35%和68.48%，具有显著变化(p<0.05)。同时，Vero细胞狂犬病疫苗免疫组的免疫反应性没有提高。然而，注射明矾或AuNPs吸附的疫苗在免疫后的总抗体水平IgG中记录了强烈的增强效应，其值分别为171.74%和138.04%，与对照组相比显著增加p<0.05，与Vero细胞狂犬病疫苗组相比显著增加。因此，与单独的明矾组或AuNPs组相比，明矾& Vero细胞狂犬病疫苗组和AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗组均显示出免疫后估计的抗体IgG水平显著增加。此外，长期免疫反应表明明矾-Vero细胞狂犬病疫苗组中的IgG水平显著高于AuNPs & Vero细胞狂犬病疫苗组。

  图4.接种后90天，用明矾、金纳米粒子(AuNPs)溶胶或狂犬病疫苗佐剂免疫的成年雄性大鼠血清中抗狂犬病免疫球蛋白(IgG)浓度(ng/mL)的比较评价。答与对照组相比有显著变化(p<0.05)。b)与疫苗(Vac)组相比有显著变化(p<0.05)。c)与明矾组相比有显著变化(p<0.05)。d)与AuNPs组相比有显著变化(p<0.05)。e)与明矾-真空组相比有显著变化(p<0.05)。

氧化剂/抗氧化剂生物标志物的评估

总抗氧化能力水平

对接种纯明矾和无佐剂狂犬病疫苗后第90天数据的研究表明，其血清中的抗氧化能力水平没有变化。同时，与对照组值相比，注射AuNPs的大鼠组的血清显示出33.33%的TAC水平增加，具有p<0.05的显著变化。Alum-Vero细胞狂犬病疫苗和AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗组均记录了其血清中TAC水平的增加，值分别为66.67%和50.0%，与对照值相比有显著变化，p<0.05，但两组均显示出与Vero细胞狂犬病疫苗组相比有显著的轻微增加，如所示表1.

  表1。 接种后90天，用明矾、金溶胶或狂犬病疫苗佐剂免疫的成年雄性大鼠血清中抗氧化剂/氧化剂状态的比较评价

数值表示为平均值的平均标准误差(相对于对照值的差异%)。

金纳米粒子；Vac，疫苗；总抗氧化能力水平；丙二醛含量；超氧化物歧化酶活性；谷胱甘肽过氧化物酶活性。

答与对照组相比有显著变化(p<0.05)。b)与Vac组相比有显著变化(p<0.05)。c)与明矾组相比有显著变化(p<0.05)。d)与AuNPs组相比有显著变化(p<0.05)。e)与明矾-真空组相比有显著变化(p<0.05)。

丙二醛含量

结果显示在表1显示Vero细胞狂犬病疫苗、明矾和AuNPs组的血清显示出MDA水平的降低，与对照组值相比，值分别为-15.55%、-9.66%和-44.96%，具有p<0.05的显著变化。同时，与对照组值相比，明矾& Vero细胞狂犬病疫苗和AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗组分别显示出-33.40%和-30.67%的血清MDA含量值的急剧下降，与Vero细胞狂犬病疫苗、明矾和AuNPs治疗组中的对照组值相比，具有p<0.05的显著变化。

超氧化物歧化酶活性

与对照组值相比，狂犬病疫苗接种、明矾和AuNPs施用显示SOD水平分别显著(p<0.05)升高2.29%、7.39%和11.32%表1).与对照组相比，明矾-Vero细胞狂犬病疫苗和AuNP-Vero细胞狂犬病疫苗组也可能诱导SOD水平的显著升高(p<0.05)，分别为15.94%和19.12%。此外，AuNP-Vero细胞狂犬病疫苗组与明矾-Vero细胞狂犬病疫苗组相比，血清SOD活性显著升高。

谷胱甘肽过氧化物酶活性

数据显示在表1揭示了单独疫苗、明矾、AuNPs、明矾-Vero细胞狂犬病疫苗和AuNP-Vero细胞狂犬病疫苗组施用后的AuNP水平记录了显著的(p<0.05)增加值，与阴性对照值相比，分别为6.43%、26.32%、27.29%、42.50%和46.59%。此外，与Vero细胞狂犬病疫苗、明矾和AuNPs组值相比，在施用明矾-Vero细胞狂犬病疫苗和AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗后检测到的谷胱甘肽水平显示出显著增加(p<0.05)。

组织病理学检查

大鼠肝组织的显微照片(图5)取自对照组的标本显示肝小叶的正常排列，其包括垂直于中央静脉的放射状板状或束状多面体肝细胞，相邻肝细胞之间具有胆管(图5A)。暴露于狂犬病非佐剂疫苗的动物切片显示肝细胞轻度肿胀。还注意到肝窦和中央静脉的扩张(图5B)。暴露于明矾的动物显示肝细胞轻度肿胀和枯否细胞增生(图5C)。明矾佐剂狂犬病疫苗组表现为细胞质肿胀、粒度(图5D)。来自AuNPs组的切片显示肝细胞的肿胀和粒度。肝窦狭窄，枯否细胞增生（图5E)。暴露于AuNPs佐剂狂犬病疫苗的动物的肝脏显示肝细胞变性变化和枯否细胞增生(图5F)。肾组织切片(图6)显示肾实质的正常组织结构，其特征为完整的肾小球和肾小管(图6A)。在Vero细胞狂犬病疫苗组中暴露于狂犬病非佐剂疫苗的动物的肾脏显示出肾小球簇轻度收缩和小管上皮衬里肿胀(图6B)。另一方面，明矾组和明矾佐剂狂犬病疫苗组的肾切片显示与对照组相似(图6C，D)。同时，从AuNPs组获得的肾脏切片显示完整的肾小球和毛细血管簇。肾小管，尤其是近曲小管，显示出上皮衬里的退化性变化(图6E)。AuNPs-Vero细胞狂犬病疫苗组的动物显示肾小球簇收缩和肾小管上皮衬里坏死(图6F)。脾脏组织切片的研究(图7)显示了脾实质组织的正常组织结构，其特征在于具有明显的中央小动脉(图7A)。暴露于狂犬病非佐剂疫苗的动物的脾脏显示淋巴细胞的增殖(图7B)。单独的明矾和明矾佐剂狂犬病疫苗组的脾脏显示轻度至中度的淋巴滤泡增生(图7C，D)。对AuNPs组切片的检查显示淋巴滤泡增生(图7E)。同时，接种AuNPs佐剂狂犬病疫苗组的动物显示淋巴滤泡增生(图7F)。

  图5.(A–F)接种90天后，用明矾、金纳米粒子(AuNPs)溶胶或狂犬病疫苗佐剂免疫的成年雄性大鼠肝组织切片的组织病理学变化，用苏木精和伊红(×200)染色。(A)对照组的肝脏显微照片显示肝小叶的正常组织结构(H&E，×200)。(B)来自AuNPs组的肝脏的显微照片显示肝细胞的肿胀和粒度(H&E，×200)。(C)AuNP-Vac组的肝脏显微照片显示肝细胞变性变化和单核细胞浸润(H&E，×200)。(D)来自初始疫苗(Vac)组的肝脏显微照片显示肝细胞轻度肿胀，具有囊状核(H&E，×200)。(E)明矾-醋酸乙烯酯组的肝脏显微照片显示肝细胞肿胀，具有细胞质粒度(H&E，×200)。(F)明矾组的肝脏显微照片显示肝细胞轻度肿胀和枯否细胞增生(H&E，×200)。

图6. (A–F)接种90天后，用明矾、金纳米粒子(AuNPs)溶胶或狂犬病疫苗佐剂免疫的成年雄性大鼠肾脏组织切片的组织病理学变化，用苏木精和伊红(×200)染色。(A)对照组肾脏的显微照片，显示肾小球和肾小管的正常组织结构(H&E，×200)。(AuNPs组肾脏的显微照片，显示肾小管上皮衬里的变性变化和坏死箭头(H&E，×200)。(C)AuNP-Vac组的肾脏显微照片，显示肾小管上皮衬里坏死箭头(H&E，×200)。(D)疫苗(Vac)组肾脏的显微照片，显示肾小球簇轻度收缩(箭头)(H&E，×200)。(E)来自Alum-Vac组的肾的显微照片显示了肾小管上皮衬里的轻度变性变化(H&E，×200)。(F)明矾组肾脏的显微照片，显示具有透明管腔的完整肾小管上皮衬里(H&E，×200)。

图7. (A–F)接种90天后，用明矾、金纳米粒子(AuNPs)溶胶或狂犬病疫苗佐剂免疫的成年雄性大鼠脾组织切片的组织病理学变化，用苏木精和伊红(×200)染色。(A)对照组脾脏的显微照片，显示正常的组织结构(H&E，×200)。(AuNPs组脾脏的显微照片，显示淋巴滤泡增生和大量巨噬细胞箭头(H&E，×200)。(C)AuNP-Vac组的脾脏显微照片，显示淋巴滤泡增生和含铁血黄素颗粒沉积箭头(H&E，×200)。(D)疫苗(Vac)组脾脏的显微照片，显示淋巴细胞增殖，小动脉静脉壁增厚箭头(H&E，×200)。(E)来自明矾-Vac组的脾的显微照片显示淋巴滤泡的中度增生(H&E，×200)。(F)明矾组脾脏显微照片，显示淋巴滤泡轻度增生(H&E，×200)。

了解佐剂如何激活免疫反应对于合理的疫苗设计非常重要，以便根据抗原和防止感染所需的免疫类型来定制反应.因此，本研究计划评估使用AuNPs作为狂犬病病毒疫苗佐剂的可能性，以对抗目前使用的明矾佐剂狂犬病疫苗。谷丙转氨酶和谷草转氨酶被认为是肝病的决定因素，尤其是谷丙转氨酶是显示肝细胞损伤的最可靠的生化指标。成年大鼠的肝和肾功能指数在正常范围内变化。这些升高可归因于肝细胞的轻微损伤，这反映在ALT水平的增加多于AST，因为ALT密集地位于肝细胞的胞质溶胶中。先前关于AuNPs的研究表明，雄性大鼠注射后3天对血清ALT、AST、ALP活性、尿素和肌酸酐水平没有不利影响，但记录了注射后7天ALT、AST和尿素水平升高，并在注射后60天恢复到正常水平。尽管狂犬病疫苗接种被认为是安全的，但据报道，在接种抗狂犬病疫苗后，在人类中出现了一例罕见的诱发肾小球性肾炎和肾小管性疾病的病例，这与目前的结果一致，表明在3、7和14天后，血清尿素和肌酐水平有不同的变化，尽管这些值有所增加，但与对照组相比，它们仍在肾功能的正常范围内。这些变异可归因于过度免疫刺激导致的超敏反应，过度免疫刺激导致了致病性免疫复合物的产生。

根据目前的结果，据报道，肌酸酐水平取决于肾小球功能的速度，肾小球功能指示肾功能。肌酐水平高于正常值表明患有慢性肾病。此外，较低浓度的AuNPs在肌酸酐和血尿素水平方面没有表现出严重的毒性。同时，更高浓度的AuNPs引起器官指数的显著变化，并且AuNPs在组织中的分布是形状依赖性的，并且最受影响的器官是心脏、肺、肝、脾、肾、胸腺、脑、生殖器官以及血液。

关于细胞免疫标记物(IL-6和IFN-γ),所记录的数据与那些表明抗原向抗原呈递细胞的有效递送仍然是疫苗接种的重大挑战的数据一致。同样，据报道，施用明矾后，嗜酸性粒细胞活化增强，促进嗜中性粒细胞的流入并增强促炎细胞因子和趋化因子的分泌。病毒感染产生促炎性细胞因子(各种促炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子[TNF]-α、IL-1和IL-6)，通过募集巨噬细胞、T和B细胞，增强细胞(成纤维细胞、间充质细胞、内皮细胞和许多其他细胞)IL-6的转录或翻译以及TNF-α、IL-6和IFN-β与其受体的结合，引起过度炎症反应，并导致JAK/STAT途径的激活，该途径通过数百个基因启动IFN转录。IFN-γ(一种多效性细胞因子)具有多种生物学反应，包括保护免受病毒和细菌感染、抗肿瘤作用，以及作为先天性和适应性免疫中效应细胞的关键环节和调节剂。IFN-γ由自然杀伤细胞和免疫系统的其他特化细胞产生。JAK信号转导子/STAT转录激活子途径通过与在大多数细胞中表达的受体结合来激活IFN-γ信号。它被认为是细胞因子级联的主开关，包含大量通过不同受体起作用的独立分子。此外，IFN-γ通过一氧化氮诱导的增强抑制细胞内病毒复制，导致有效的病毒清除。

此外，发现明矾通过细胞坏死诱导内源性危险信号，细胞坏死引发导致体液免疫的炎症相关细胞因子。此外，据报道，与外周来源的巨噬细胞免疫活性细胞相比，存在于明矾基佐剂中的聚集形式的铝盐在脑来源的星形胶质细胞中引起氧化或炎症反应，这表明伴随着细胞因子分泌的特定特征的细胞活力降低。纳米粒子作为疫苗递送平台的使用显示出显著的进步，在新型疫苗设计中发挥了重要作用，在提高疫苗效力方面发挥了重要作用，并提供了作为疫苗载体的独特优势，因为这些纳米粒子防止了过早的抗原释放，同时延长了抗原呈递，从而对传染病产生了有效的免疫作用。此外，由于一些疫苗的低免疫原性、毒性和不稳定性，纳米技术被纳入疫苗开发。这些优点源于它们相当的尺寸，使得纳米粒子能够附着到生物实体上而不改变它们的功能，同时纳米粒子的高表面积-体积比允许与表面活性剂分子牢固结合。在本研究中，40 nm球形AuNPs作为狂犬病疫苗的佐剂在接种后第3天和第7天诱导了IL-6水平的升高，但持续增加直到AuNPs佐剂疫苗免疫的第14天，超过了检测到的明矾佐剂疫苗。类似地，发现40 nm球形AuNPs注射诱导炎性细胞因子产生，包括TNF-α、IL-6、IL-12、IL-10和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，表明AuNPs是有效的疫苗佐剂，可以根据其大小和形状通过不同的细胞因子途径增强免疫反应。

AuNPs通过穿透各种免疫细胞激活促炎细胞因子的产生。INF-γ主要由辅助性T(Th)1细胞分泌，该细胞在许多免疫调节过程中起重要作用，包括单核吞噬细胞的激活，并且在感染期间的早期在血清样品中检测到Th1标记细胞因子(INF-γ和IL-2 ，表明Th1反应在感染后被促进。在目前的研究中观察到，与对照组和单一疫苗组(非佐剂疫苗)相比，在免疫接种后第3、7和14天，大鼠血清中的INF-γ水平极度升高，这可能反映了INF-γ作为抗病毒剂保护大鼠免受病毒攻击的重要作用，与世界卫生组织报告的增强Th1细胞应答一致在活生物体内明矾盐增加IFN-γ诱导。与明矾佐剂疫苗相比，金纳米粒子佐剂疫苗免疫的大鼠血清中TNF-γ水平明显升高，这些结果与周等的结果一致。世界卫生组织指出，Th1细胞因子的分泌增加，如使用球体AuNPs的IFN-γ，并夸大了AuNPs产生的IL-1、IL-6和IFN-γ的增加，因为用AuNPs免疫的动物显示出Th1/Th2(分别为IFN-γ和IL-10)免疫应答，表明这些动物具有发展记忆性T细胞的能力，以保护其免受未来随后的挑战，表明AuNPs作为疫苗佐剂在增强免疫应答中的有效性。一般来说，本文中关于AuNPs的数据表明，有效的基于AuNPs的疫苗应该是不同大小和形状的颗粒的混合物，其被设计用于诱导更广泛和更强的免疫反应。因为特异性抗体对于防止病毒感染非常重要。最有效的抗体类型是中和抗体，它结合病毒，病毒包膜或衣壳蛋白，并阻止病毒结合和进入宿主细胞。针对狂犬病病毒抗原的体液免疫应答是时间依赖性的，明矾佐剂选择性地刺激Th2免疫应答和其他免疫调节分子，导致分泌Th2细胞相关抗体同种型IgG和免疫球蛋白E (IgE)的B细胞产生增加。

尽管铝基佐剂在引发疫苗的免疫原性方面提供了非常重要和有用的工具，但可能有一组特定的个体易受含明矾疫苗不良后果的影响。这些后果包括其仅通过低浓度就能产生神经反应的能力，因为发现基于明矾的佐剂对细胞介导的免疫具有最小的诱导作用，并引发不期望的IgE反应。此外，安体内研究显示，AuNPs激活B细胞，刺激抗体合成并增强IgG分泌，这与提供的数据一致。体内和体外研究表明，AuNPs的免疫反应是形状和大小依赖性的，因为发现使用球形AuNPs后诱导的抗体水平最高，表明AuNPs引起更大的总抗原特异性抗体应答，并认为AuNPs是增强长期保护性免疫的理想佐剂。

几种机制使任何哺乳动物机体能够抵御氧化应激，包括小分子抗氧化剂，如谷胱甘肽，和抗氧化剂清除酶，如GPx，SOD和过氧化氢酶。在本研究中，与对照组相比，AuNPs佐剂狂犬病疫苗组的TAC水平、SOD和GPx活性增加，而MDA水平(表明脂质过氧化)降低。这些结果与Abdelhalim等人的观点部分一致，他们发现，腹腔注射10nm aun PS 3天和7天后，大鼠肾、肝和肺中的GPx、TAC、谷胱甘肽和MDA增加，而SOD水平显著下降，MDA水平可能是器官依赖性的。GPx在保护细胞免受由过氧化物分解形成的自由基诱导的损伤中起着至关重要的作用。细胞的脂质成分特别容易与自由基反应，导致脂质过氧化。GPx酶利用谷胱甘肽作为底物将过氧化物还原成醇，从而防止自由基的形成。在生理条件下，谷胱甘肽还原酶迅速将任何氧化型谷胱甘肽还原成其硫醇形式(谷胱甘肽)。目前的结果表明，AuNPs的抗氧化作用，反映在TAC，SOD和GPx的增加。由于SOD是最重要的抗氧化酶之一，它通过催化超氧化物歧化为过氧化氢和氧而在防御氧化应激中起重要作用。

脂肪酸过氧化的主要产物MDA也被证实具有诱变剂和致癌物的作用，并通过触发导致细胞死亡或凋亡的信号转导途径产生脱氧鸟苷、脱氧腺苷和脱氧胞苷而导致DNA损伤。这里，注射AuNPs后MDA水平降低，表明GPx水平升高。AuNPs的潜在抗氧化能力及其在猝灭活性氧簇(ROS)中的有效性包括H2O2超氧阴离子自由基2和超氧阴离子自由基(O2-)呈剂量依赖性。

所呈现的结果表明，在明矾注射后，TAC水平没有变化，MDA含量降低，SOD和GPx活性增加，并且在AuNPs组中MDA水平的降低和SOD和GPx活性的升高比明矾免疫组更明显。与目前的结果一致，据报道，在饮用水中用硫酸铝(1，000 ppb)处理大鼠后，谷胱甘肽还原酶、GPx和SOD活性增加。他们将这些变化归因于铝浓度和给药途径，这导致了组织中的氧化应激和脂质过氧化，从而引起损伤，因为它在血液中循环，并通过取代转铁蛋白来干扰铁的体内平衡，导致铁释放到血液中，与分子氧相互作用并产生超氧阴离子，从而产生高活性的羟基自由基。

与对照组和单独疫苗组相比，明矾和AuNPs佐剂狂犬病疫苗给药诱导TAC水平、SOD和GPx活性升高，而MDA水平在接种后90天下降。施用AuNPs后SOD活性比施用明矾后增加，表明其清除自由基的能力更强。另一方面，基于明矾的佐剂后非特异性ROS的形成在试管内并且报道了在施用明矾后72小时后，ROS增加并伴随着细胞活力降低。

接种后，在所有组中检查肝、肾和脾的组织病理学特征。明矾给药后的肝脏切片显示肝细胞轻度肿胀和枯否细胞增生。同时，施用AuNPs诱导了轻度肿胀、枯否细胞增生和中央静脉扩张。观察到用AuNPs治疗后大鼠肝脏出现浑浊肿胀，这可能归因于肝细胞膜功能的缺陷。同时，在施用狂犬疫苗、明矾吸附疫苗和AuNPs佐剂狂犬疫苗后检查的大鼠肝组织显示肝细胞肿胀。在所有组中观察到的肿胀可能伴随着溶酶体水解酶的渗漏，导致细胞质变性和大分子拥挤。本研究中所有治疗组的肝脏组织病理学图片以及肝功能参数表明，8周后可能会诱发肝毒性，这可能是由于明矾或AuNPs在肝组织中的积聚，取决于颗粒大小和持续时间。

在肾脏中检测到的组织病理学变化显示，AuNPs和AuNPs佐剂狂犬病疫苗组都比其他组显示出肾脏损伤的迹象，这可能归因于AuNPs的不可逆累积，这与之前报道的明矾的情况不同。以肾小球簇收缩和近曲小管上皮衬里变性变化为代表的肾损伤表现为肿胀和有时坏死。AuNPs在肾脏中的分布取决于它们的大小和浓度。纳米颗粒浓度和聚集的增加会对肾脏的功能和组织造成不可修复的损害。因此，在医疗领域应用少量低浓度的AuNPs不会产生严重的危害。

本研究显示明矾组、明矾吸附疫苗组和AuNPs组的脾组织显示淋巴滤泡增生。它们的生发中心含有大量的“易染体”巨噬细胞。AuNPs疫苗混合物组的脾组织显示淋巴滤泡增生和金黄色含铁血黄素颗粒沉积。AuNPs组给药后观察到的结果与Fu等人的结果一致，他发现用AuNPs处理后脾组织的淋巴细胞增殖增加，这是剂量依赖性的。已经证实，脾脏发育并产生成熟的免疫细胞，这些细胞能够识别并破坏病原体。因此，在本研究中观察到的淋巴组织增生通过明矾、AuNPs单独给药或与狂犬病疫苗一起辅助给药而增强，刺激了免疫反应。

从目前的数据可以得出结论，明矾和AuNPs作为佐剂都是免疫反应的良好增强剂，表现为IL-6、INF-γ和总抗狂犬病IgG水平的升高。基于AuNPs的佐剂引发更多的免疫反应，这由INF-γ和IL-6水平的高增加来指示。此外，AuNPs显示出抗氧化特性，其证据是TAC的增加和非常低水平的MDA。此外，AuNPs狂犬病疫苗混合物组中的SOD活性比明矾吸附疫苗组中的SOD活性更高。此外，明矾和基于AuNPs的佐剂都引起肝和肾功能边界附近的改变，尽管肝和肾组织中很少变性。最后，更大的免疫反应表明，AuNPs作为一种免疫增强剂使其具有更好的长期免疫增强潜力。可以通过选择更合适的大小、形状和浓度来克服AuNPs的不良影响，使其更适合用于疫苗递送。

El-Hennamy REE, Mahmoud SM, El-Yamany NA, Hassanein HH, Amer ME, Mohamed AF. Comparative evaluation of gold nanoparticles and Alum as immune enhancers against rabies vaccine and related immune reactivity, physiological, and histopathological alterations: in vivo study. Clin Exp Vaccine Res. 2023 Jan;12(1):32-46. doi: 10.7774/cevr.2023.12.1.32. Epub 2023 Jan 31. PMID: 36844690; PMCID: PMC9950229.