体外和体内试验评估狂犬病疫苗诱导的抗体中和台湾蝙蝠狂犬病病毒的能力

狂犬病是一种被忽视的热带疾病。原型病毒，狂犬病病毒，每年仍然导致数万人死亡。狂犬病是狂犬病病毒属的一员。其他狂犬病病毒的负担还不清楚。新型狂犬病病毒的不断出现意味着评估疫苗对这些病毒的效力至关重要，因为标准狂犬病疫苗不是对所有狂犬病病毒都有效。台湾蝙蝠lyssavirus (TWBLV)是在2018年首次从日本家蝙蝠中分离出来。自从最初的检测和基因表征以来，没有人试图从抗原性上定义这种病毒。由于野生型分离物的不可接近性，描述了活重组病毒cSN-TWBLV的成功产生，其中用TWBLV的糖蛋白构建了RABV疫苗株SAD-B19的全长基因组克隆。进行了cSN-TWBLV的体外和体内表征，并证明了cSN-TWBLV与种系群I特异性血清和狂犬病病毒标准血清的交叉中和作用的证据。为了中和相当于0.5 IU/mL的抗CVS的世卫组织和世界动物卫生组织(WOAH)血清，需要0.5 IU/mL的WOAH血清和2.5 IU/mL的世卫组织血清来中和cSN-TWBLV。此外，与其他种系群I特异性血清相比，ARAV和EBLV-1的特异性血清表现出最高的抗cSN-TWBLV中和抗体滴度。

狂犬病是由狂犬病病毒(RABV)和一种称为狂犬病病毒的新兴病毒属中的相关病毒种引起的。狂犬病病毒的持续出现对人类群体具有重要意义，因为狂犬病病毒总是与症状发作后的死亡有关。在该属中，从全球动物和人类健康的角度来看，RABV是最重要的狂犬病病毒，并且据称每年导致数万人死亡，其中大多数死亡发生在非洲和亚洲，在那里狂犬病在狗群中流行。然而，所有的狂犬病病毒都能引起狂犬病。因此，随着每个新发现的病毒种类的出现，对狂犬病病毒的兴趣，特别是那些在遗传或抗原上与RABV不同的病毒。弹状病毒科中的狂犬病病毒属包括越来越多的已鉴定和分类的病毒。在过去的20年中，已经检测到17种公认的狂犬病病毒中的9种，以及两种新的暂定病毒种，这两种病毒种仍有待于在该属中正式分类。非RABV lyssaviruses的负担是不确定的；此前仅报告了14例人类狂犬病病毒相关死亡病例。这一统计数据可能并不代表真实的感染负担，因为流行地区的诊断能力通常仅限于临床诊断和抗原检测，无法区分不同的狂犬病病毒种类。

除了物种的遗传分类外，基于免疫学、病理学和遗传特征，狂犬病病毒被分为三个不同的类群。上市的人用狂犬病疫苗可提供针对I型狂犬病病毒的保护性免疫，这些病毒包括:澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒(ABLV)、Aravan狂犬病病毒(ARAV)、Bokeloh蝙蝠狂犬病病毒(BBLV)、Duvenhage狂犬病病毒(DUVV)、欧洲蝙蝠1型狂犬病病毒(EBLV-1)、欧洲蝙蝠2型狂犬病病毒(EBLV-2)、Gannoruwa蝙蝠狂犬病病毒(GBLV)、伊尔库特狂犬病病毒(IRKV)、苦盏狂犬病病毒(KHUV)和RABV。利用现有狂犬病疫苗在动物模型中进行的疫苗接种和攻击研究已经确定，在疫苗接受者中诱导的抗体滴度与针对I型狂犬病病毒的免疫力直接相关。虽然0.5 IU/mL的抗体滴度以前与抗经典RABV的交叉保护的可能性增加有关，但证据表明抗非RABV血清型I病毒需要更高的中和抗体滴度。相比之下，对疫苗效力的评估表明，现有疫苗无法提供针对第二类(Lagos bat virus, Mokola virus, Shimoni bat virus)和第三类(Ikoma lyssavirus, Lleida bat lyssavirus, West Caucasian bat virus)狂犬病病毒的保护作用。

2016年和2017年，在台南市和云林县两只日本伏翼鹨(阿布拉伏翼)。分离出病毒后，这些病毒被命名为台湾蝙蝠丽莎病毒(TWBLV )，每种病毒蛋白的基因组序列显示它是一种独特的丽莎病毒。在遗传学上，当比较串联的编码基因时，TWBLV与EBLV1 (75%)和IRKV (74%)密切相关。最近，2018年和2020年在两只日本伏翼中检测到了TWBLV-2。在同一项研究中，一只细毛夜莺(绒毛白夜行)对lyssavirus呈阳性反应，这是台湾首例感染这种病毒的病例。这种狂犬病病毒在遗传上不同于TWBLV和其它狂犬病病毒，暂定名为TWBLV-2。在这些研究中，基于这些初步的遗传分析，TWBLV被归入系统群I；然而，迄今为止还没有尝试在体内或体外对这种病毒进行抗原性表征。

在对该病毒进行抗原性表征的尝试中，产生了代表野生型TWBLV的活重组病毒。狂犬病病毒糖蛋白(G)是病毒表面唯一的病毒蛋白，通过与细胞表面受体的相互作用介导病毒进入细胞。因此，狂犬病病毒G是中和抗体的唯一靶标。先前利用反向遗传学技术将疫苗载体的RABV G与另一种狂犬病病毒的G进行交换的研究确定，这些重组病毒与在体液应答中表达相同G的野生型病毒在抗原性上无法区分。在本研究中，使用含有TWBLV G的重组病毒来确定疫苗衍生的血清和疫苗诱导的抗体中和并提供针对该病毒的保护的能力。

尽管具有毁灭性的健康、社会和经济影响，狂犬病仍然是一种被忽视的热带疾病。此外，人类对更偏远生态系统的持续入侵加剧了来自蝙蝠的狂犬病病毒的人畜共患威胁。狂犬病疫苗和有限情况下的狂犬病暴露后免疫球蛋白是防止疾病发展为感染后临床不可治愈的脑炎的唯一工具。然而，对该属更多样化成员的保护是有限的。因此，新的狂犬病病毒的发现保证了对遗传多样性、抗原性和疫苗效力的深入研究。

虽然TWBLV已被分离并被正式归入狂犬病病毒属；以前只调查了基因分类。TWBLV的共享基因组数据使得TWBLV G ORF的合成和cSN-TWBLV重组病毒的随后产生成为可能。在这项研究中，成功拯救的病毒能够在体外复制，并通过体外交叉中和试验和体内疫苗接种攻击研究，在没有野生型TWBLV病毒的情况下进一步进行抗原表征。

该病毒的生长动力学评估显示，尽管成功拯救了病毒，但cSN和cSN-TWBLV之间的终点滴度显著不同，cSN-TWBLV达到较低的滴度(图1).此外，cSN-TWBLV在48 hpi时达到峰值，滴度为1.13×105ffu/mL，而cSN在48小时后达到峰值，滴度> 107ffu/mL。与亲本毒株cSN相比，滴度的降低可能反映了种间G蛋白替代后的次优蛋白相互作用。这可能是由于与异源M蛋白的公正或不完全的相互作用，导致G蛋白在病毒表面的次优装配，尽管这一假设需要检验。病毒适合度降低的另一个假设是新的亲本病毒在细胞培养中比重组cSN-TWBLV病毒具有更低的病毒适合度。虽然以前已经分离出野生型病毒，但是还没有报道过细胞培养中的病毒适应性。在以前的研究中，野生型EBLV-1和-2分离株的滴度比重组cSN-EBLV(在研究中称为SN-1和SN-2)低，表明观察到的低滴度不是G蛋白依赖性过程(如受体结合和病毒进入)的结果，而是对体外病毒复制和装配的适应性差。最后，所用的G基因针对人类表达进行了密码子优化。在以前的研究中，RABV G基因的密码子优化/去优化降低/减缓了病毒在体外的生长。密码子优化/去优化对病毒生长的影响可能极大地影响cSN-TWBLV在体外和体内的生长。

为了评估TWBLV-G蛋白的抗原性，用一组特异于不同狂犬病病毒G蛋白的血清进行mFAVNs。TWBLV G蛋白和其他lyssaviruses的氨基酸序列同一性决定了EBLV-1 (AAX62856)、EBLV-2 (AGG81481)、KBLV (LR994545)、ARAV (YP_007641395)和IRKV (YP_007641400)与TWBLV G最接近，具有74.7%、72.3%、71.7%、71.3%和70.6%的同一性。这通常也与交叉中和试验相关(图3)，因为EBLV-1特异性血清显示最高滴度的抗cSN-TWBLV中和抗体，而ARAV特异性血清显示第二高滴度的中和抗体。然而，RABV特异性血清显示出第三高的中和抗体滴度，尽管序列同一性高，EBLV-2特异性血清不能中和cSN-TWBLV超过0.5 IU/mL的临界值。最后，RABV特异性血清不能中和超过0.5 IU/mL阈值的CVS，表明街毒RABV株和诊断试验中常用的CVS之间的抗原差异。这与先前的一项研究相一致，该研究确定实验室适应的RABV毒株(如CVS)在抗原性上不同于更大范围的WT-RABV毒株。此外，在交叉中和试验中使用血清学数据测量抗原差异受到数据中矛盾或不规则性的限制，如针对同一抗原产生的血清之间的个体差异，或针对不同狂犬病病毒种的不同分离株产生的血清的绝对定量的困难。

使用抗原制图，如前所述，以定量分析抗原数据。cSN-TWBLV与ABLV、cSN、cSN-KBLV、EBLV-1和IRKV的抗原距离最近，分别为1.12 AU、1.58 AU、1.59 AU、1.68 AU和1.85 AU。除了ABLV和cSN，cSN-TWBLV位于最接近与TWBLV G具有最相似氨基酸百分比同一性的病毒的位置。然而，这些距离必须谨慎解释，因为这些抗原图谱在平均预测误差中的分辨率先前已被确定为1.2 (SE，0.17)抗原单位。

由于EBLV-1和IRKV与TWBLV密切的抗原和遗传关系，预计现有的狂犬病疫苗将能够提供针对该病毒的保护。对于EBLV-1，体外分析表明，中和需要滴度≥4.5 IU/mL。在本研究中，体外中和试验证明，为了中和cSN-TWBLV，在血清学截止值之上，需要2.5 IU/mL世卫组织血清或1.0 IU/mL WOAH血清的抗体滴度。与cSN-TWBLV相比，WOAH标准血清显示抗CVS的中和抗体滴度高1.1倍。cSN、CVS和cSN-TWBLV的不同中和特性证实了G是中和抗体的主要靶标的假设。当使用100 TCID50/50μL的标准激发剂量时，这些值仅预测了体内抗cSN-TWBLV保护作用的保守阈值。因此，进行了体内疫苗接种攻击研究。

接种疫苗的小鼠存活到实验结束；然而，用cSN-TWBLV攻击的模拟免疫小鼠也存活至实验期结束。这是非常不寻常的，因为在该鼠模型中，当接种ic时，cSN病毒导致临床疾病和死亡，因此该结果表明包含密码子优化的TWBLV G已经减毒了亲代cSN病毒。

体内致病性可能是TWBLV G密码子优化的结果。以前的研究表明，密码子优化/密码子去优化的狂犬病病毒G基因在体内的致病性降低。在这项研究中，密码子去优化，加上观察到重组病毒传统上表现出对野生型病毒的病毒适应性降低，可以形成这样的假设，即这些因素的组合导致cSN-TWBLV的生长降低和致病性降低。然而，在无法获得活病毒感染性病毒分离株的情况下，这仍然是一个假设，需要在未来的研究中确定。

在本研究的体内实验之后，通过尸检获得的样品分析显示，使用脂肪和IHC方法在cSN-TWBLV感染的小鼠的脑中不能检测到狂犬病毒特异性抗原。然而，通过SYBR实时RT-PCR在cSN-TWBLV模拟接种的小鼠中检测到病毒RNA，表明病毒感染和随后的清除。在cSN-TWBLV接种的小鼠中，在小鼠的大脑中没有检测到来自攻击病毒的病毒抗原或病毒RNA。先前的研究表明，感染后，病毒RNA水平与病毒中和抗体成反比。当然，在实验结束时，存活下来的模拟接种cSN-TWBLV感染的小鼠表现出高水平的中和抗体。此外，cSN-TWBLV接种的小鼠组在接种后但在攻击前具有强中和抗体，这将导致比模拟接种的对照组更早的病毒清除。这些因素可能有助于通过脑材料的实时RT-PCR检测观察到的结果，因为cSN-TWBLV接种组中的病毒RNA在28 dpi时已经被清除。本研究中的血清学评估还表明，与疫苗病毒相比，cSN-TWBLV疫苗接种组显示出抗攻击病毒的中和抗体滴度没有增加，而cSN-TWBLV模拟疫苗接种组显示出抗攻击病毒的中和抗体滴度明显高于疫苗病毒，表明模拟疫苗接种小鼠中存在狂犬病病毒感染和随后的清除。

总之，当通过ic途径接种时，cSN-TWBLV构建体在体内是无毒的。尽管如此，体外实验表明，中和需要最低1 IU/mL的疫苗保护。在遗传学上，TWBLV G与EBLV- 1、EBLV-2、KBLV、ARAV和IRKV密切相关。交叉中和试验显示，EBLV-1、ARAV和RABV lyssavirus特异性血清显示出针对cSN-TWBLV的最高中和抗体，抗原图谱数据显示cSN-TWBLV与ABLV、cSN、cSN-KBLV、EBLV-1和IRKV聚类。需要进一步的研究，最好以野生型病毒作为对照，以检测TWBLV的毒力。

Shipley R, Wright E, Smith SP, Selden D, Fooks AR, Banyard AC. Taiwan Bat Lyssavirus: In Vitro and In Vivo Assessment of the Ability of Rabies Vaccine-Derived Antibodies to Neutralise a Novel Lyssavirus. Viruses. 2022 Dec 9;14(12):2750. doi: 10.3390/v14122750. PMID: 36560754.