2018-2021年台湾省发现的新型蝙蝠病毒

摘要

2016-2017年期间，在台湾省的蝙蝠种群中发现了蝙蝠病毒。继续实施狂犬病病毒监测系统以了解流行病学。通过该系统，收集发现的死蝙蝠，通过直接荧光抗体试验和逆转录聚合酶链反应进行狂犬病病毒检测。在2018-2021年期间，有三种蝙蝠被鉴定为阳性。一种新的病毒被命名为台湾省蝙蝠病毒2号，在绒山蝠(Nyctalus plancyi velutinus)中发现。这种狂犬病病毒在核蛋白(N)基因中与其他狂犬病病毒物种的核苷酸同一性低于80%，在系统发育分析中形成了一个单独的分支。另外两个病例是在东亚家蝠（学名：Pipistrellus abramus）(日本伏翼)；它们被鉴定为与2016–2017年鉴定的前丽莎病毒相似，在本研究中被重新命名为台湾蝙蝠丽莎病毒1 (TWBLV-1)。尽管与其他TWBLV-1分离株相比，其中一个TWBLV-1分离株在N基因上表现出较高的遗传多样性，但基于其在核蛋白中的高氨基酸同一性、与其他TWBLV-1相同的宿主物种和相同的地理位置，它可能是TWBLV-1的变体，而不是新物种。

关键词: 狂犬病病毒属； 蝙蝠； 台湾省； 绒山蝠； 东亚家蝠

1.介绍

迄今为止，国际病毒分类委员会(ICTV)已经正式承认了17种狂犬病病毒。另外两种假定的新狂犬病病毒已经发表。在过去的五年中，在世界范围内发现了更多的狂犬病病毒物种。这些新的狂犬病病毒符合ICTV的狂犬病病毒物种划分标准:与已知的狂犬病病毒相比，在整个核蛋白(N)基因或连接的编码区上分别具有少于78–80%或80%的核苷酸同一性，并且在系统发育分析中形成单系群。尽管狂犬病病毒在基因上是不同的，但所有的狂犬病病毒都会导致致命的疾病狂犬病。在狂犬病病毒中，根据它们的免疫原性和遗传多样性，它们被分成至少三个进化群。目前的狂犬病疫苗提供了针对血清型I狂犬病毒的部分或完全保护，但不提供针对血清型II和III狂犬病毒的有效保护。

目前大多数研究表明，蝙蝠是狂犬病病毒的宿主，除了莫科拉丽莎病毒（Mokola lyssavirus，MOKV和伊科马丽莎病毒（Ikoma lyssavirus，IKOV)。在亚洲，狂犬病病毒在狗和许多野生动物中传播；相比之下，其他五种狂犬病病毒，阿拉文丽莎病毒(Aravan lyssavirus ,ARAV)、库贾德丽莎病毒（Khujand lyssavirus，KHUV)，伊尔库特丽莎病毒 (Irkut lyssavirus，IRKV)、甘诺鲁瓦蝙蝠丽莎病毒（Gannoruwa bat lyssavirus，GBLV)，以及台湾蝙蝠丽莎病毒(TWBLV) ，只存在于蝙蝠中。所有在亚洲流行的狂犬病病毒都属于第一群。在台湾省发现了两种狂犬病病毒。台湾省，在2013年鼬獾（学名：Melogale moschata）中发现，另一种是蝙蝠病毒，在2016年在东亚家蝠(日本伏翼)中发现。为了监测台湾省蝙蝠群中狂犬病病毒的活动，被动狂犬病病毒监测系统已在台湾省实施多年。因此，在2018年至2021年期间，发现了另一种新的蝙蝠丽莎病毒并对其进行了表征。

2.材料和方法

2.1.样品收集、狂犬病病毒诊断和病毒分离

本研究中实施的狂犬病病毒监测系统和诊断方法已在前面描述过。简言之，发现的死蝙蝠由非政府组织和当地动物疾病检查机构收集，并于2018-2021年提交给动物健康研究所。蝙蝠在生物安全2级实验室中进行尸检，并通过直接荧光抗体试验(FAT)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析它们的脑组织。

使用FAT检测狂犬病病毒抗原，将脑涂片用两种市售FITC偶联的抗狂犬病抗体(Catalog No. 800-092, Fujirebio Diagnostic Inc., Malvern, PA, USA； Catalog No. 5100, EMD Millipore Corporation, Temecula, CA, USA)。

为了通过RT-PCR测试病毒RNA，将脑组织匀浆成10%(w/v)在最小必需培养基中进行脑匀浆，离心后将上清液用于核酸提取。通过RT-PCR检测狂犬病病毒RNA，使用两套RT-PCR引物JW12/N165-146和N113F/N304R 。试剂制备和热循环条件按照相应的参考文献进行。

当FAT或RT-PCR给出阳性结果时，进行病毒分离。简而言之，10%的上清液(w/v)将脑匀浆与3 × 10⁶/mL小鼠成神经细胞瘤细胞的悬浮液混合，并将混合物在37℃下在1% CO2孵育后，将混合的脑匀浆细胞悬浮液转移到烧瓶和一些对照载玻片中，培养3-4天。固定一个对照载玻片，每天用FITC缀合的抗狂犬病抗体染色，用于检查可能的荧光。当在4天孵育后没有观察到荧光时，进行几次盲传。

2.2.蝙蝠种类的鉴定

如前所述，蝙蝠物种通过外部形态特征进行鉴定。对于丽莎病毒阳性病例，蝙蝠的种类通过DNA条形码得到进一步确认。

2.3.狂犬病病毒分离株的全基因组测序

对于狂犬病病毒的全基因组扩增，使用了12套RT-PCR引物，并根据分离物的序列对一些引物进行了修饰。使用SuperScript III一步RT-PCR系统和Platinum Taq聚合酶高保真试剂盒(Invitrogen，Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)按照制造商的说明进行RT-PCR。反应在42℃下开始40分钟，然后在95℃下开始2分钟，接着是35个循环，95℃下40秒，50℃下50秒，72℃下80秒，最后在72℃下延长7分钟后反应结束

使用SMARTer RACE试剂盒(Clontech Laboratories，TaKaRa Bio Company，Mountain View，CA，USA)按照制造商的说明获得病毒基因组3’和5’末端的末端序列。由于蝙蝠脑组织的数量有限，从病毒分离物的细胞培养上清液中提取的核酸用于末端序列的扩增。

RT-PCR产物用3700XL DNA分析仪进行测序。

2.4.系统发育分析

使用在软件分子进化遗传分析X版中实施的MUSCLE程序，将本研究中获得的N基因序列与从GenBank中检索的代表性狂犬病病毒株的序列进行比对。使用系统发生学推理软件IQ-TREE中实现的ModelFinder评估核苷酸取代和分配方案的最佳模型。用IQ-TREE2 v2.1.3 构建最大似然种系发生树，用1000个超快速bootstrap复制估计分支支持。IQ树生成的系统进化树由Figtree v1.4.4程序进一步编辑和可视化(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/于2019年9月16日访问)。

在分析中使用的所有代表性的狂犬病病毒的基因组序列是 Rabies lyssavirus (RABV； GenBank accession number: NC001542), Lagos bat lyssavirus (LBV； NC020807), Mokola lyssavirus (MOKV； NC006429), Duvenhage lyssavirus (DUVV； NC020810), European bat lyssavirus 1 (EBLV-1； NC009527), European bat lyssavirus 2 (EBLV-2； NC009528), Australian bat lyssavirus (ABLV； NC003243), Aravan lyssavirus (ARAV； NC020808), Khujand lyssavirus (KHUV； NC025385), Irkut lyssavirus (IRKV； NC020809), West Caucasian bat lyssavirus (WCBV； NC025377), Shimoni bat lyssavirus (SHIBV； NC025365), Ikoma lyssavirus (IKOV； NC018629), Bokeloh bat lyssavirus (BBLV； NC025251), Lleida bat lyssavirus (LLEBV； NC031955), Gannoruwa bat lyssavirus (GBLV； NC031988), Taiwan bat lyssavirus (TWBLV； NC055474), Kotalahti bat lyssavirus (KBLV； LR994545), and Matlo bat lyssavirus (MBLV； MW653808)。除了上述代表性序列之外，使用了GenBank中每个物种的更多丽莎病毒序列，在本研究中总共使用了233个序列。在系统发育树中，系统群III丽莎病毒被用作外群。

此外，如上所述，分别比对鉴定的狂犬病病毒和代表性序列的相应编码区(即N基因、磷蛋白基因、基质蛋白基因、糖蛋白基因和RNA依赖性RNA聚合酶基因)的序列。使用Lasergene软件第7版的MegAlign程序(DNASTAR Inc .，Madison，WI，USA)计算每个基因中已鉴定的狂犬病病毒和代表性序列之间的核苷酸同一性百分比。

GenBank中ABLV N基因的核苷酸和氨基酸序列用于验证狂犬病病毒基因型内核苷酸和氨基酸同一性的范围。如前所述对序列进行比对，并使用BioEdit中的序列同一性矩阵工具计算核苷酸序列之间和氨基酸序列之间的同一性，以获得所分析的狂犬病病毒的基因型内同一性。

2.5.组织病理学检查

当诊断出丽莎病毒阳性病例时，对其中枢神经系统和唾液腺的组织进行调查以发现可能的病变。将这些新鲜组织固定在10%缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并用苏木精和伊红染色进行组织病理学检查。

3.结果

3.1.狂犬病病毒监测

从2018年到2021年，动物卫生研究所共接收和检测了407只蝙蝠标本。这些标本涵盖了至少13种蝙蝠，来自台湾省的18个城市或县(表S3).在收到的标本中，62.7% (N = 225)是东亚家蝠，是一种分布在台湾省全岛的蝙蝠(图S1).通过RT-PCR和FAT检测，407份蝙蝠标本中有3份为狂犬病病毒阳性。通过DNA条形码确认蝙蝠的种类，2018年和2020年的两只分别是东亚伏翼，另一个在2018年被确定为绒山蝠这是在台湾省发现的首例感染病例。通过病毒分离回收三个阳性病例的狂犬病病毒，分别命名为TWBLV-1/YiL/2018、TWBLV-1/KL/2020和TWBLV-2/NT/2018。阳性病例的FAT试验、RT-PCR和病毒分离的结果列于表S4.在台湾省发现的蝙蝠狂犬病毒的分离株、蝙蝠种类、位置和年份列于表1.

表1.被动监测期间台湾省蝙蝠体内分离出的狂犬病病毒。

* TWBLV-1:台湾蝙蝠丽莎 1；TWBLV-2:台湾蝙蝠丽莎病毒2。分离物的原始名称为TWBLV(台湾蝙蝠丽莎病毒)，在本研究中，TWBLV被重新命名为TWBLV-1。

3.2.全基因组测序和系统发育分析

分离株TWBLV-2/NT/2018的全基因组长度为11，990个核苷酸，G + C含量为43.17%。TWBLV-2/NT/2018与其他狂犬病病毒的核苷酸相似性在N基因中为70.7-79.6%，在连接的编码基因中为63.3-76.2%(表2)。在狂犬病病毒中，TWBLV-2/NT/2018的N基因与TWBLV (79.1~79.6%)、EBLV-1 (79.1%)、IRKV (78.1%)和DUVV (78%)的N基因具有最高的核苷酸同一性。系统发育分析表明，TWBLV-2/NT/2018被分在系统群I中，与TWBLV(图1)。根据ICTV对狂犬病病毒的分类标准，TWBLV-2/NT/2018被认为是狂犬病病毒的新种，命名为台湾蝙蝠丽莎病毒2(TWBLV-2)。作为在台湾省蝙蝠体内发现的一种新的狂犬病病毒，最初在普通伏翼P.abramus中发现在本文重新命名为台湾蝙蝠丽莎病毒1(TWBLV-1)。

图1.2018年在台湾省绒山蝠发现的一种新的狂犬病病毒(红色字体)的系统发育关系。对来自GenBank的所有丽莎病毒种及其分离物的代表的核苷酸序列进行了分析。在台湾省发现的台湾蝙蝠狂犬病病毒1分离株用蓝色字体标记。最大似然系统发育由全长核蛋白序列通过IQ-TREE使用具有1000超快速自举的核苷酸取代的最佳拟合模型构建。节点上的数字表示支持超快自举。III型狂犬病病毒被用作外群。由相同的丽莎病毒物种组成的分支被折叠，物种名称标注在右侧。比例尺表示每个位点的替换数。详细的进化树和所有基因组的登录号如所示图S2。阿拉文丽莎病毒(Aravan lyssavirus ,ARAV)；澳大利亚蝙蝠丽莎病毒 (Australian bat lyssavirus，ABLV)；博克洛蝙蝠丽莎病毒(Bokeloh bat lyssavirus,BBLV)；杜文黑基丽莎病毒(Duvenhage lyssavirus，DUVV)；欧洲蝙蝠丽莎病毒1型 (European bat 1 lyssavirus，EBLV-1)；欧洲蝙蝠丽莎病毒2型 (European bat 1 lyssavirus，EBLV-2)；甘诺鲁瓦蝙蝠丽莎病毒（Gannoruwa bat lyssavirus，GBLV)；伊科马丽莎病毒（Ikoma lyssavirus，IKOV)；伊尔库特丽莎病毒 (Irkut lyssavirus，IRKV)；库贾德丽莎病毒（Khujand lyssavirus，KHUV)；拉各斯蝙蝠丽莎病毒（Lagos bat lyssavirus，LBV)；莱里达蝙蝠丽莎病毒（Lleida bat lyssavirus，LLEBV)；莫科拉丽莎病毒（Mokola lyssavirus，MOKV)；狂犬病丽莎病毒（Rabies lyssavirus，RABV，即最常见的经典的狂犬病毒)；希莫尼蝙蝠丽莎病毒（Shimoni bat lyssavirus，SHIBV)；台湾蝙蝠丽莎病毒1 ( Taiwan bat lyssavirus 1，TWBLV-1)；西高加索蝙蝠丽莎病毒 (West Caucasian bat lyssavirus ， WCBV)；台湾蝙蝠丽莎病毒 2( Taiwan bat lyssavirus 2，TWBLV-2)。

表2.台湾蝙蝠丽莎病毒2和其他丽莎病毒之间的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、RNA依赖的RNA聚合酶(L)基因和串联编码基因(N + P + M + G + L)的核苷酸同一性(%)。

*狂犬病病毒原名为台湾蝙蝠丽莎病毒，本研究将台湾蝙蝠丽莎病毒重新命名为台湾蝙蝠丽莎1。

分离株TWBLV-1/YiL/2018和TWBLV-1/KL/2020的完整基因组序列与2016年和2017年的TWBLV-1分离株进行了比较。2016年和2017年鉴定的TWBLV-1/KL/2020与TWBLV-1的核苷酸相似性在N基因中为98.5~99.0%，在串联的编码基因中为98.6~98.9%(表3)。本研究中鉴定的狂犬病病毒的基因组结构列于表S5.

表3.(A)台湾蝙蝠丽莎病毒1 (TWBLV-1)分离株和澳大利亚蝙蝠丽莎病毒(ABLV)分离株的核蛋白基因的基因型内核苷酸和氨基酸同一性。(B)台湾蝙蝠丽莎病毒1 (TWBLV-1)和台湾蝙蝠丽莎病毒2 (TWBLV-2)的核蛋白基因之间的核苷酸和氨基酸的百分比同一性(下划线)。

*狂犬病病毒原名为TWBLV（台湾蝙蝠丽莎病毒），本研究将TWBLV重新命名为TWBLV-1。

TWBLV-1/YiL/2018与其他三个TWBLV-1分离株的核苷酸相似性在N基因上为81.2~81.4%，在串联编码基因上为79.7~79.8%，符合2018年的标准(完整N基因为80–82%，或串联编码区为80%)。因此，TWBLV-1/YiL/2018可能是一种新的狂犬病病毒。为了验证丽莎病毒基因型内核苷酸和氨基酸同一性的范围，从GenBank中收集ABLV序列，并在本研究中进行进一步分析。N基因的核苷酸和氨基酸的基因型内同源性分别为83.6～100%和95.5～100%表3)，分别为。推测分离物TWBLV-1/YiL/2018属于TWBLV-1，其中N基因的核苷酸和氨基酸的基因型内一致性为81.2~99%和96.2~100%，这与RABV (93.7~99.0%)、EBLV-1(97.8 ~ 100%)、EBLV-2(97.3 ~ 99.8%)和ABLV (95.5~100)的一致性。

3.3.组织病理学检查

三个阳性病例中的两个，TWBLV-1/KL/2020和TWBLV-2/NT/2018，适合组织病理学检查。其余病例因其死后标本变化程度严重而被排除。在分离出TWBLV-2/NT/2018的绒山蝠大脑中观察到神经元变性和坏死以及具有不同数量的单核细胞的血管周围皱缩。在绒山蝠大脑和分离出TWBLV-1/KL/2020的abramus的脊神经节中的神经元胞质中观察到病理性病原体Negri体(卵圆形，长度约2 m )(图2)。在两个病例的唾液腺中也发现了不同程度的淋巴细胞浸润。

图2.在被台湾省蝙蝠丽莎病毒 1分离株TWBLV-1/KL/2020感染的脊神经节神经元中发现了各种大小的卵圆形胞浆内嗜酸性包涵体(Negri小体，用箭头表示)。

4.讨论

据作者所知，在绒山蝠(Nyctalus plancyi velutinus)检出的丽莎病毒TWBLV-2。该狂犬病病毒与其他狂犬病病毒物种在N基因上的核苷酸同一性低于80%；因此，在系统发育分析中形成了一个独立的分支。结果显示，我们研究中的TWBLV-2分离物TWBLV-2/NT/2018符合ICTV制定的狂犬病病毒新种标准。基于完整N基因的系统进化树显示，TWBLV-2/NT/2018与TWBLV-1、EBLV-1和DUVV聚在一起，属于系统群I丽莎病毒。

一个TWBLV-1变异体TWBLV-1/YiL/2018东亚家蝠来自台湾省宜兰县。基于TWBLV-1/YiL/2018与其他TWBLV-1分离物(96.2%)在核蛋白上的高度氨基酸同一性，以及相同的宿主物种(东亚伏翼)和相同的地理分布(台湾省)，我们认为该分离物属于TWBLV-1而非新种。此外，对于2021年的完整N基因，狂犬病病毒的ICTV分界标准从80–82%下调至78–80%核苷酸同一性，因此也支持TWBLV-1/YiL/2018是TWBLV-1的变体。不同于在不同蝙蝠物种中发现的ABLV变种(狐蝠和黄腹墓蝠) ，TWBLV-1仅在东亚伏翼发现，在地理上，TWBLV-1/YiL/2018是在台湾省东部发现的唯一TWBLV-1分离物(图S1)。发现于台湾省西部的其他TWBLV-1分离物在N基因上有98.5~99%的核苷酸相似性。台湾省中部从北到南都有山脉。东部地区和西部地区之间的高海拔山地地理屏障可能有助于TWBLV-1在东亚伏翼中的独立进化，从而导致这种遗传多样性。已经提到了基于地理分离的狂犬病病毒的不同分支；同样，地理障碍导致了宿主遗传的不连续性。

在本研究中，我们报告说绒山蝠可能是TWBLV-2的潜在宿主。对绒山蝠的监测越多，越有证据表明绒山蝠是TWBLV-2的宿主还是偶然感染的。绒山蝠是中华山蝠的亚种发现实验动物山蝠，分布于中国东部、台湾省和菲律宾吕宋岛。在台湾省，绒山蝠广泛分布于中低海拔地区；它不是一种常见的蝙蝠物种，种群数量未知。在2011年至2021年期间，从台湾路杀观察网络共收到14条绒山蝠的路杀记录。同样，我们在2018年至2021年期间仅收到4例绒山蝠病例(4/407，1%)。这表明绒山蝠在该国是一种很少观察到的物种。尽管蝙蝠与人类接触的可能性很小，而且在台湾省只发现了一个TWBLV-2分离株，但我们的研究结果表明，周围的东亚国家也可能面临类似的风险。绒山蝠与夜行属中的其他山蝠(褐色大蝙蝠和小山蝠) 具有相似的潜在长距离迁移能力，可能是合格宿主，负责蝙蝠狂犬病病毒国际传播。

TWBLV-1的宿主是东亚伏翼，其在台湾省确诊了4例。东亚伏翼是东亚城市地区常见的非迁徙性食虫蝙蝠。TWBLV-1在东亚伏翼2018~2021年的流行为(2/225，0.89%)。东亚伏翼在台湾省是最常被发现的路毙动物。此外，接收的蝙蝠物种62.7%是东亚伏翼本研究反映该物种与台湾省人有高度接触的可能性。应提高公众健康意识，避免蝙蝠与人接触，以预防人间病例。

蝙蝠感染TWBLV-1或TWBLV-2可在受感染蝙蝠的中枢神经系统中形成组织病理学损伤。尽管在这些病例中没有记录到明确的神经症状，但我们在TWBLV-1和TWBLV-2感染的蝙蝠的神经元中观察到了特征性的Negri小体。在先前的研究中，在实验性接种的蝙蝠中发现了攻击和攻击行为，一些被感染的蝙蝠变得消瘦，然后死亡。为了进一步研究台湾省蝙蝠病毒在蝙蝠体内的临床症状、潜伏期和传播途径，需要进行深入的研究以了解这些蝙蝠病毒在蝙蝠体内的致病性和发病机理。

这种被动监测系统大大拓宽了我们对台湾省蝙蝠病毒的了解。与此同时，它在收集稀有物种样本方面存在局限性和/或偏见。尽管在我们的被动监测系统的研究中，一些物种很少或从未接受和检测过狂犬病病毒，但这种监测仍然提供了有价值的信息。在欧洲和亚洲实施的几个监测系统表明，与对健康蝙蝠的拭子进行主动监测相比，被动监测更适合于鉴定感染狂犬病病毒的蝙蝠。一旦通过被动监测确定了蝙蝠物种的目标，就可以对病原体监测、群体间的病毒传播或血清阳性率进行进一步的研究。此外，将鼓励在其他国家对特定蝙蝠物种进行相关的狂犬病病毒监测，以填补狂犬病病毒在全世界蝙蝠中分布的空白。

总之，在绒山蝠中新分离鉴定了一种蝙蝠病毒，命名为TWBLV-2。该病毒分离株符合作为一个假定的新病毒种的标准，其流行病学和致病性值得进一步研究。

补充材料

以下内容可从以下网址在线获得https://www.mdpi.com/article/10.3390/v14071562/s1表S1:本研究中分离株全基因组序列中使用的修饰引物；表S2:包括在系统发育树构建中的狂犬病病毒属物种的参考序列；表2018年至2021年监测中检测到的蝙蝠数量和种类详情；表S4:阳性病例的结果，采用不同的诊断方法；表S5:台湾省已鉴定的狂犬病病毒的基因组结构；图S1:台湾省岛的地图，显示了经过测试的东亚家蝠2018~2021年期间按县/市划分；图S2:狂犬病病毒核蛋白基因的详细系统进化树。

Viruses. 2022 Jul 18；14(7):1562. doi: 10.3390/v14071562.

Novel Bat Lyssaviruses Identified by Nationwide Passive Surveillance in Taiwan, 2018-2021

PMID: 35891542