氢气吸入对晚期头颈部肿瘤放疗患者血清代谢组的影响

 背景

氢气吸入可选择性调控活性氧（ROS），有望减轻治疗引发的氧化损伤。本研究探讨同步放化疗（CCRT）期间辅助氢气吸入对局部晚期头颈部肿瘤（LAHNC）患者血清代谢组图谱及临床治疗毒性的影响。

 方法

将20例患者前瞻性随机分为单纯标准同步放化疗组（A组）、同步放化疗联合辅助氢气吸入组（B组）。采集患者治疗前后血清样本，基于非靶向超高效液相色谱-离子淌度四极杆飞行时间高分辨质谱（UHPLC-IM-QTOF-HRMS）开展代谢组学检测分析。

 结果

B组1例患者中途退出研究，最终纳入19例完成数据分析。与单纯同步放化疗患者相比，联合氢气吸入患者中度治疗相关毒性发生率数值更低、化疗延期次数更少、总治疗时长更短。单纯同步放化疗组治疗后检测到精氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、嘌呤代谢相关代谢物出现探索性改变；鸟氨酸、尿酸、四氢脱氧皮质酮是同步放化疗后具有潜在区分效能的候选差异代谢物。与之不同，联合氢气吸入组代谢通路富集模式更单一，单一代谢通路映射的探索性证据提示嘌呤代谢可能参与其中。尿酸水平波动联合多种脂质代谢物改变，可共同反映同步放化疗期间与治疗诱导氧化应激相关的机体代谢应答。组内治疗前后差值（Δ=治疗后-治疗前）的组间直接对比结果显示，氢气辅助吸入组血清尿酸下降幅度数值更小，但该差异无统计学意义。

 结论

局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗期间辅以氢气吸入，可能降低中度治疗相关毒性发生率，并使机体全身代谢图谱产生探索性改变。但本研究未设计评估肿瘤学终点；且代谢组相关结果（尤其是通路层面解读）仅作探索性参考：多条代谢通路仅依靠单个或少数映射代谢物注释，加之样本量有限、患者异质性大、缺乏独立外部验证队列。仍需扩大独立队列样本量，开展全面组间代谢组对比分析进一步验证本研究结论。

Metabolomic Alterations Associated with Adjunctive Hydrogen Gas Inhalation During Concurrent Chemoradiotherapy in Locally Advanced Head and Neck Cancer: A Pilot Study

 1 前言

同步放化疗（CCRT）是局部晚期头颈部肿瘤（LAHNC）标准根治方案，相较于单纯放疗，可更好控制肿瘤、延长患者生存期。但该方案常伴随明显急性期与远期不良反应，包括口腔黏膜炎、吞咽困难、口干、听力损伤等。上述不良反应会严重降低患者生活质量，部分患者甚至无法完整完成规范治疗。调强放疗（IMRT）等放疗新技术虽减少了部分并发症，但远期毒性仍显著影响临床诊疗。一项纳入21项随机对照试验的汇总分析显示，采用现代放疗技术行同步放化疗的局部晚期头颈部肿瘤患者中，17%出现3级及以上远期咽炎、16%发生3级及以上吞咽困难、38%存在2级及以上口干[1]。

放疗造成组织损伤的核心机制是大量活性氧（ROS）生成，尤其是羟基自由基（·OH），诱发正常组织氧化应激与细胞损伤。现有研究尝试各类方案（如自由基清除剂）缓解放疗相关氧化损伤[2]。羟基自由基活性强、细胞毒性高，电离辐射诱发组织损伤的相关作用已在体内外模型中得到充分证实[3]。多种传统抗氧化剂虽在临床前研究中表现出放射防护作用[2]，但如何在不削弱肿瘤杀伤效果的前提下选择性保护正常组织，仍是临床难点。

分子氢气（H₂）是近年备受关注的选择性抗氧化物质。现有研究认为氢气可优先与高活性氧化剂（羟基自由基）发生反应，而对参与细胞信号传导、具备生理功能的活性氧几乎无影响[3,4,5]。临床前实验证实，氢气可减少放疗诱导的DNA损伤、提升放疗后细胞存活能力[4,5]；临床研究进一步证实，健康人群长期吸入氢气安全性良好、耐受性佳，具备临床应用潜力[6]。尽管现有研究结果令人鼓舞，但现有证据表明氢气并非广谱放射保护剂，其完整生物学机制尚未阐明[3,4,5,6,7,8,9]。因此仍需开展更多机制与临床研究，明确氢气在同步放化疗中的具体作用、验证临床疗效。

基于上述研究基础，多项临床研究探究了肿瘤患者氢气吸入的安全性与潜在治疗获益。一项纳入16例调强放疗患者的回顾性研究显示，每日吸入5%氢气30 min可显著减轻放疗所致骨髓抑制，患者白细胞、血小板计数高于对照组，且未观察到抗肿瘤疗效下降[7]。另一项纳入82例肿瘤患者的队列研究显示，每日氢气吸入≥3 h、持续3个月，可改善患者乏力、失眠、疼痛症状[8]。基于前期研究成果，本团队前期预实验证实，局部晚期头颈部肿瘤患者全程33次同步放化疗期间每日吸入氢气具备可行性与安全性，无氢气吸入相关不良反应，但未探究治疗诱发的机体代谢改变[9]。

代谢组学作为系统生物学研究手段，可用于解析疾病发病机制、治疗应答规律、筛选生物标志物[10]。通过检测生物体液内小分子代谢物，代谢组学可直观反映治疗引发的细胞与全身生化改变。本研究旨在分析接受单纯同步放化疗或同步放化疗联合氢气吸入的局部晚期头颈部肿瘤患者血清代谢组变化。据我们所知，本研究是首批探究同步放化疗期间辅助氢气吸入对局部晚期头颈部肿瘤患者血清代谢组影响的临床研究之一。本研究假设：同步放化疗期间辅以氢气吸入，可使氧化应激相关代谢物与全身代谢应答通路产生可观测的探索性改变。解析该类代谢变化有助于阐释治疗相关机体生物学应答，为后续开发耐受性更好、个体化程度更高的头颈部肿瘤治疗方案提供机制与临床研究假说。为完善非靶向代谢组学分析结果，本研究针对关键代谢物计算每位患者治疗前后指标差值（Δ=治疗后-治疗前），开展组间直接对比，进一步探索氢气辅助吸入的潜在生物学效应。

 2 资料与方法

 2.1 伦理审批

本前瞻性随机干预临床试验旨在探究同步放化疗局部晚期头颈部肿瘤患者辅以氢气吸入对血清代谢组的影响。研究已在泰国临床试验注册中心完成注册，注册号TCTR20240515006（注册时间2024年5月15日）。研究方案经泰国清迈大学医学院人体研究伦理委员会批准（批准日期2024年1月30日；研究编号RAD-2566-0615；课题编号615）。试验严格遵循《赫尔辛基宣言》，所有受试者入组前均签署书面知情同意书。

 2.2 研究对象

入组标准：签署知情同意书；年龄18~70岁；美国东部肿瘤协作组体能评分（ECOG）0~2分；组织学确诊局部区域晚期头颈部肿瘤，适合根治性同步放化疗。

排除标准：远处转移、局部区域复发、既往头颈部放疗史；存在放疗、化疗、氢气吸入禁忌症；气管造口置管患者。

患者入组时间2024年3月—2025年1月（见图1）。

 2.3 氢气吸入干预方案

采用评估者单盲、分段随机方案，符合入组标准患者随机分为对照组（A组：单纯标准同步放化疗）、试验组（B组：同步放化疗联合每日氢气吸入）。

B组患者每次放疗前1~2 h经鼻导管吸入氢气，每日1 h；使用日本Helix公司Hycellvator ET 100型号氢气发生器，气流流速1.67 L/min。

两组同步放化疗方案完全一致：根据患者肾功能，每周顺铂40 mg/m²或卡铂（曲线下面积AUC=2）同步调强放疗，放疗总30~33次，周期6~6.5周[9]。

依据5.0版不良事件通用术语标准（CTCAE）每周评估两组患者同步放化疗相关毒性[11]，评估医师对分组设盲，记录每位患者全程治疗中出现的最严重不良反应。患者基线临床资料见表1。

 2.4 样本前处理

采血前患者禁食10~12 h，最大限度减少饮食干扰。所有局部晚期头颈部肿瘤患者于同步放化疗开始前、全部疗程结束后即刻使用血清分离管采集外周静脉血。室温3000转/分钟离心10 min，分离血清转移至1.5 mL离心管，-80℃冷冻保存待检测。

代谢组检测样本处理：冰上解冻血清，取150 μL血清加入450 μL 70%甲醇溶液（内含55 mg/L 4-氯-L-苯丙氨酸作为内标，购自美国Sigma-Aldrich公司）；涡旋震荡30 s，4℃条件下13000×g离心10 min；吸取上清至洁净1.5 mL离心管，经0.22 μm亲水聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤后，采用安捷伦6560型超高效液相色谱-离子淌度四极杆飞行时间高分辨质谱（UHPLC-IM-QTOF-HRMS）上机检测。

 2.5 代谢组学检测

采用安捷伦InfinityLab超高效液相色谱系统联合6560离子淌度四极杆飞行时间质谱系统完成非靶向代谢组图谱检测。

色谱分离柱：安捷伦InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z亲水作用色谱柱（填料粒径2.7 μm，规格2.1×100 mm），配套保护柱；柱温30℃，流速0.3 mL/min。

流动相：A相为含0.1%甲酸的10 mM甲酸铵水溶液；B相为水/乙腈（体积比1:9）配制的10 mM甲酸铵、0.1%甲酸混合液；进样体积4 μL。

梯度洗脱程序：0~10 min，B相浓度100%线性降至70%；10~10.5 min维持70%B；10.5~12 min恢复至100%B；100%B平衡至14 min，单次检测总时长14 min。

质谱检测采用电喷雾电离（ESI）正离子模式，全扫描质荷比（m/z）范围100~1700，同步自动二级质谱（Auto MS/MS）采集；每份样本连续进样3次技术重复，评估检测重复性。

将所有研究样本等量混合制备质控（QC）混合样本，检测序列中定期插入质控样本，监测仪器稳定性与检测可靠性。

离子源参数：干燥气温度225℃，干燥气流速13 L/min，雾化器压力60 psi；鞘气温度340℃，鞘气流速12 L/min；毛细管电压3000 V[12]。

本研究仅采集正离子模式信号，负离子模式下易电离的代谢物检出不足，仅覆盖部分代谢组；后续研究需联合正负离子模式实现更全面代谢物检测。

 2.6 数据处理与统计学分析

原始液质数据采用Progenesis QI软件（2.3版，英国Nonlinear Dynamics公司）处理，处理后数据导出开展统计学分析。同步放化疗前/后组、同步放化疗联合氢气吸入前/后组初始分别检出1169、1162个代谢物特征峰；经预处理、质量过滤后，分别保留385、389个特征峰用于后续统计分析。

代谢物注释：依据精确母离子质荷比、二级质谱碎片谱图，与人代谢组数据库（HMDB）、METLIN二级质谱数据库、诗里拉吉代谢组数据库（SiMD）匹配注释[13,14,15]；匹配标准：母离子质量偏差＜5 ppm，碎片离子质量偏差＜5 ppm；依据代谢组学标准倡议（MSI）规范标注注释置信度。本研究未同步检测标准品，所有代谢物均为推定注释；未使用碰撞横截面积（CCS）辅助注释。

富集通路、生物学解读前剔除外源性物质、药物相关代谢物、饮食来源化合物及未识别特征峰，提升结果生物学相关性与可解读性。

采用MetaboAnalyst 6.0软件分析数据集；连续变量根据分布情况以均数±标准差或中位数描述；Shapiro–Wilk检验判断数据正态性，组内前后对比采用配对t检验/威尔科克森符号秩检验，组间对比采用独立样本t检验/曼-惠特尼U检验。本研究为预实验、样本量有限，临床结局仅作描述性统计；连续临床指标组间对比采用曼-惠特尼U检验；双侧P＜0.05定义为差异具有统计学意义。

多元统计分析：主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），用于分析各组治疗前后代谢变化规律；仅用于挖掘治疗相关代谢模式，不构建预测模型、推断组间疗效差异。采用拟合优度R²、预测能力Q²评估模型性能，置换检验（置换次数n=2000）验证OPLS-DA模型稳健性与有效性。受限于样本量偏小、代谢组数据高维特性，谨慎解读多元统计结果，降低模型过拟合风险。

差异代谢物筛选标准：变量投影重要度（VIP）≥1.0，倍数变化（FC）≥1.2或≤0.83，本杰米尼-霍赫伯格校正后错误发现率（FDR）P＜0.05。

MetaboAnalyst 6.0软件绘制受试者工作特征（ROC）曲线、计算曲线下面积（AUC），评估候选代谢物对治疗相关代谢改变、氢气吸入干预的区分效能。本研究ROC曲线AUC均基于同一筛选数据集计算，仅为样本内探索性评估，无外部验证、交叉验证；AUC≥0.7提示具备可接受的探索区分效能。

基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库开展通路富集、代谢集富集分析[16,17,18,19]。

针对本研究核心差异代谢物尿酸，计算每位受试者治疗前后指标差值（Δ=治疗后-治疗前），开展靶向分析，补充非靶向代谢组结果、直接对比两组治疗诱发的代谢改变，差值组间对比采用曼-惠特尼U检验。

 3 结果

 3.1 受试者基线资料

如图1所示，共31例患者接受入组筛选，20例完成随机分组：单纯同步放化疗A组10例，同步放化疗联合氢气吸入B组10例。B组1例患者完成14次放疗后撤回知情同意、选择中草药替代治疗，终止全部干预。最终A组10例、B组9例纳入治疗依从性、急性期毒性、血清代谢组分析。

基线资料（表1）：A组、B组年龄中位数分别为55.5岁、59岁（P=0.54）；性别分布（P=0.61）、原发肿瘤部位（P=0.67）、肿瘤分期（P=0.47）、化疗方案（P=0.26）均无统计学差异。两组基线人口学、临床资料整体均衡可比，但样本量有限，难以检出微小组间差异。

 3.2 治疗依从性与总治疗时长

共19例患者纳入分析（A组单纯同步放化疗10例，B组同步放化疗联合氢气9例）。A组10例中有6例出现化疗延期，B组9例中3例化疗延期，数值存在差异但无统计学意义。B组总治疗时长中位数48.0天（区间48~49天），短于A组51.5天（区间48~56天）（表2）。上述描述性结果提示氢气辅助吸入患者治疗连续性更好，但样本量小、无统计学差异，无法得出确定性结论。

 3.2.1 急性期非血液学毒性

两组均出现轻中度放射性皮炎：A组1级皮炎6例、2级4例；B组1级7例、2级2例；两组均无3级皮炎。

咽炎以低级别为主：A组1级7例、2级3例；B组1级8例、2级1例；无3级咽炎记录。

黏膜炎严重程度组间存在数值差异：A组1级5例、2级4例、3级1例；B组1级4例、2级5例，无3级黏膜炎。

整体来看，两组同步放化疗急性期非血液毒性以1~2级为主；氢气吸入组2~3级不良反应发生例数数值更低，但组间无统计学差异（表2）。

 3.2.2 急性期血液学毒性

白细胞减少严重程度存在轻微组间差异：A组0度3例、1度1例、2度4例、3度2例；B组0度4例、1度3例、2度2例，无3度病例，组间无统计学差异。

中性粒细胞减少以轻度为主：A组0度3例、1度4例、2度2例、3度1例；B组0度4例、1度4例、2度1例，无3度病例。

血小板减少发生率低：A组0度8例、1度2例，无2度；B组0度8例、2度1例，无1度。

两组血液毒性整体以0~2级为主，全程仅少数患者出现3级毒性，组间无统计学差异（表2）。

末次随访截至2026年2月：A组7例、B组8例无病灶残留；A组2例、B组1例出现局部区域复发；两组均无远处转移；随访期间A组1例患者因肿瘤死亡。但本研究样本量有限、随访周期短，试验设计未评估肿瘤学终点，上述临床结局仅作描述性报告，不可作为两组复发、生存、肿瘤控制等肿瘤学指标存在差异的证据。

 3.3 血清代谢组图谱分析

 正文翻译

为进一步明确治疗诱导的代谢改变，并探究辅助氢气吸入带来的潜在生物学应答，本研究开展血清代谢组图谱检测，分析同步放化疗引发的代谢变化，同时探索联合氢气吸入后机体特征性代谢应答。A、B两组局部晚期头颈部肿瘤患者血清采集方案（分别于同步放化疗前后、有无氢气吸入干预下采血）详见补充图S1。两组治疗前后样本基峰色谱图对比均可见明显差异，提示同步放化疗会诱发机体代谢组改变；与单纯同步放化疗A组相比，氢气联合同步放化疗B组质谱图谱模式同样存在区别，说明两组治疗相关代谢模式可能存在差异，但该结果仅为描述性观察，不能直接作为氢气特异性调控代谢的证据。

 3.4 多元统计分析

本研究采用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），评估A、B两组局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗前后血清样本的代谢改变。

单纯同步放化疗A组：经数据预处理与质量过滤后，共保留385个代谢物特征峰用于后续分析。OPLS-DA模型可清晰区分治疗前、治疗后样本（拟合优度R²Y=0.988，预测能力Q²=0.948）；而PCA、PLS-DA模型组聚类区分度较弱（图2a~d）。采用2000次置换检验评估模型稳健性，证实组间区分具备统计学有效性；但受样本量偏小、代谢组数据高维特征限制，解读该结果需谨慎（P＜0.0005）。

氢气联合同步放化疗B组：经预处理、质量过滤后共保留389个代谢物特征峰开展分析。OPLS-DA模型同样可明显区分治疗前后样本（R²Y=0.991，Q²=0.918），PCA与PLS-DA的样本分离效果更弱（图2e~h）。2000次置换检验进一步验证模型稳定，但样本量有限无法完全排除模型轻度过拟合风险（P＜0.0005）。

综上，两组OPLS-DA模型均能区分治疗前后血清样本，为后续差异代谢物筛选、通路富集分析提供探索性支撑证据，但不能直接证实治疗存在确定性代谢调控效应。

 3.5 局部晚期头颈部肿瘤患者单纯同步放化疗后的差异代谢物及代谢通路改变

基于OPLS-DA模型结果开展差异代谢物分析，筛选同步放化疗前后血清样本中由治疗诱发的代谢改变。液质联用数据预处理与质控过滤后，共纳入385个代谢物特征峰进行统计分析：其中54个代谢物显著上调、34个显著下调、212个无明显改变，剩余85个未完成鉴定或注释（图3a）。

采用更严格筛选标准（变量投影重要度VIP＞1.0、倍数变化FC≥1.2或≤0.83、错误发现率校正后P＜0.05），共筛选出63个差异代谢特征峰；其中36个在治疗前样本中丰度更高，27个于治疗后表达升高（补充表S1）。区分效能排名前15的血清代谢物见图3b，包括鞘磷脂、胞苷二磷酸二甘油酯、磷脂酰-N-甲基乙醇胺、神经酰胺、甘油三酯、N-癸酰甘氨酸、尿酸、四氢脱氧皮质酮、鸟氨酸、(2S,3R)-2-氨基-3-[(2S)-氨基-3-羟基丙酰]氧代丁酸。

鞘磷脂、甘油三酯等多种脂质代谢物，以及氨基酸类代谢物均表现出较高VIP值，提示该两类代谢物质是同步放化疗诱发代谢改变的核心组分。后续生物学解读剔除外源性物质、未鉴定代谢物及生物学功能尚不明确的代谢分子。

为评估上述代谢物区分治疗前后样本的能力，开展受试者工作特征（ROC）曲线分析。共30个代谢特征峰具备初步区分效能（曲线下面积AUC≥0.7），AUC区间0.70~0.92（95%置信区间：0.57~0.98）；其中以鞘脂、甘油磷脂、中性脂质等脂质代谢物为主，同时包含氨基酸与氮代谢相关分子（表3）。

京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析得到多条仅匹配单一代谢物的提示性通路，提示精氨酸生物合成、D-氨基酸代谢通路可能参与治疗应答（P＜0.05）；谷胱甘肽代谢、精氨酸与脯氨酸代谢、嘌呤代谢、类固醇激素生物合成等通路，也仅依靠单个或少数映射代谢物获得通路注释（图3c、表4）。

值得注意的是，鸟氨酸是唯一同时匹配多条KEGG通路的代谢物，涵盖精氨酸合成、D-氨基酸代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸脯氨酸代谢，但仅提示上述通路可能发生波动，无法证实通路整体显著扰动。与治疗前相比，治疗后鸟氨酸水平显著升高（校正后P=5.8×10⁻⁴，AUC=0.78，特异度81%，灵敏度83%）（图3d、表3）。

与之相反，治疗后尿酸水平较治疗前显著下降（校正后P=1.7×10⁻⁵，AUC=0.87，特异度81%，灵敏度87%），该变化或与嘌呤代谢、氧化应激应答相关（图3e、表3）。

同步放化疗后四氢脱氧皮质酮水平同样显著降低（校正后P=5.4×10⁻⁵，AUC=0.79，特异度77%，灵敏度77%），提示类固醇激素代谢发生改变（图3f、表3）。

但上述通路富集结果解读需十分谨慎：绝大多数富集通路仅依靠1个或极少数代谢物完成映射。

 3.6 局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗联合氢气吸入后的差异代谢物及代谢通路改变

基于上述OPLS-DA模型，进一步分析同步放化疗联合氢气吸入患者治疗前后血清样本，筛选干预相关代谢改变。液质数据预处理与质控过滤后，共389个代谢特征峰纳入差异分析；其中303个完成注释并用于火山图绘制：31个代谢物治疗后显著升高，49个显著降低，223个无统计学差异；剩余86个代谢特征峰未完成鉴定或注释不足，不纳入后续生物学解读（图4a）。

按照预设筛选标准（VIP＞1.0、FC≥1.2或≤0.83、校正后P＜0.05），共得到43个差异代谢特征峰；其中30个代谢物在治疗前丰度更高，13个在同步放化疗联合氢气吸入后表达上调（补充表S2）。按VIP值排序前15位候选代谢物见图4b。

剔除外源性物质与未鉴定分子以排除无关干扰后，剩余差异代谢物以脂质、氨基酸类为主，包含鞘磷脂、甘油三酯、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、脯氨酰天冬酰胺、丁酰肉碱、同型L-精氨酸、尿酸。鞘磷脂、甘油三酯、磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱等脂质分子VIP值普遍偏高，提示同步放化疗会显著改变机体脂质代谢应答。

采用ROC曲线评估上述代谢物区分氢气联合放化疗治疗前后样本的能力（表5）。共18个代谢特征峰具备初步区分效能，样本内AUC范围0.70~0.88（95%置信区间：0.58~0.95）；差异分子主要关联脂质代谢与氨基酸代谢，多个分子已被既往研究证实参与氧化应激应答。

KEGG通路映射仅得到一条单一代谢物匹配通路，提示嘌呤代谢通路可能参与干预应答（图4c）：该通路注释仅依托尿酸分子（P=0.04），且治疗后尿酸水平较治疗前显著下降（图4d、表5）。尿酸区分效能中等（校正后P=4.5×10⁻³，AUC=0.79，特异度74%，灵敏度70%）。尿酸是嘌呤分解代谢核心终产物，上述结果提示同步放化疗联合氢气吸入后，机体嘌呤代谢、氧化应激相关代谢通路发生改变。

尿酸在两组干预队列中均为最突出的治疗相关差异代谢物，因此后续专门针对血清尿酸的治疗前后变化开展组间直接对比，进一步分析氢气吸入的干预效应（3.7节）。但通路解读需保持审慎：该通路仅依靠单一代谢物注释，仅用于提供生物学背景参考，不能证明通路整体发生实质性扰动；此外，本研究未开展完整的组间代谢组横向对比分析。

 3.7 两组患者血清尿酸自身前后变化的组间直接对比

尿酸在两组中均为关键差异代谢物，也是嘌呤代谢通路初步富集的核心分子，因此本研究直接对比两组患者尿酸自身前后差值（Δ=治疗后-治疗前），探索尿酸的治疗波动是否存在组间差异。

氢气干预组尿酸下降幅度数值上小于单纯同步放化疗组，但组间差异无统计学意义（P=0.11，表6）。该结果提示辅助氢气吸入可能小幅削弱同步放化疗所致的血清尿酸下降，但无法证实氢气可特异性调控嘌呤代谢，仅可作为探索性发现。

尽管氢气组中度治疗毒性发生率数值更低，与尿酸下降幅度减小的现象同步出现，但二者无法推导因果关系，仍需大样本、检验效能充足的临床试验验证该规律。

 4 讨论

本团队前期预实验证实，局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗期间每日氢气吸入具备可行性、耐受性良好，无氢气相关不良反应，整体安全性可控[9]。本随机预试验共纳入19例局部晚期头颈部肿瘤患者，分别接受单纯同步放化疗、同步放化疗联合氢气辅助吸入（表1、图1）。两组均出现中度治疗相关毒性，包括放射性皮炎、咽炎、口腔黏膜炎、白细胞减少、中性粒细胞减少，氢气吸入组不良反应发生例数数值更低。截至2026年2月随访节点，氢气干预组随访期内未出现肿瘤相关死亡病例。

但受样本量有限、随访周期短制约，上述临床结局仅作描述性报告，不能作为两组肿瘤学预后存在差异的证据（表2）。本试验设计初衷并非评估抗肿瘤疗效与远期生存，上述初步结果仅证实同步放化疗期间辅助氢气吸入短期安全可行；仍需扩大样本量、延长随访周期，明确其临床疗效与长期肿瘤结局。

既往多项研究同样证实氢气吸入安全性良好，可减轻放疗诱导组织损伤且不削弱抗肿瘤效果。例如，宫颈癌同步放化疗患者吸入氢气可降低急性放射性肠炎严重程度[19]。机制层面，氢气是公认的选择性抗氧化物质：可中和高活性羟基自由基（·OH）与过氧亚硝基阴离子（ONOO⁻），同时保留参与正常细胞信号传导、具备生理功能的活性氧[20]。除抗氧化作用外，现有研究证实氢气可在氧化应激损伤的正常组织中发挥抗炎、细胞保护效应[4,5,20]。氢气暴露的时机与持续时长会直接影响其生物学作用。受临床诊疗流程限制，本研究选择每次放疗前1~2 h吸入氢气，每日1 h。吸入氢气扩散速度快、可快速全身分布[21,22]，未来可优化氢气吸入与放疗的时间搭配，进一步探究其调控氧化应激的最优方案。

尽管两组毒性反应存在数值差异，氢气作用的底层生物学机制尚未完全阐明。因此本研究采用非靶向超高效液相色谱-离子淌度四极杆飞行时间高分辨质谱血清代谢组学开展探索性分析，明确有无氢气辅助吸入时，同步放化疗诱导的全身代谢改变。同步放化疗后氨基酸、脂质、嘌呤代谢通路的波动，可反映机体针对治疗应激、治疗毒性产生的全身性代谢应答[23,24]。

在所有差异代谢物中，鸟氨酸可映射至多条KEGG通路，包含精氨酸生物合成、D-氨基酸代谢、谷胱甘肽代谢、精氨酸脯氨酸代谢（图3c）。鸟氨酸（图3d）是精氨酸代谢关键中间产物，同时为多胺合成前体[25,26]；同步放化疗后鸟氨酸升高，可能是细胞受治疗刺激后，精氨酸分解、多胺相关通路激活的代偿表现。鸟氨酸稳态失衡也与全身炎症、细胞应激应答密切相关[25-28]。

鞘磷脂、甘油三酯水平改变提示细胞膜脂质周转、细胞损伤应答发生波动：鞘脂、甘油三酯通路直接参与细胞膜重塑、炎症与应激信号传导、肿瘤细胞存活调控[29,30]。既往研究证实放射线可扰动鞘脂通路，尤其是神经酰胺相关信号，进而诱导细胞凋亡、激活炎症反应[31]。

同步放化疗后尿酸下降反映嘌呤代谢紊乱（图3e）：尿酸是嘌呤分解终产物，特定生理条件下具备抗氧化活性[32]。因此尿酸降低更可能是机体应对同步放化疗氧化应激的代谢代偿，而非氢气吸入特异性标志物[32-34]。但血清尿酸水平受肾功能、机体水化状态、饮食、肿瘤负荷多重因素调控，顺铂还会损伤肾功能，解读尿酸变化时需将上述混杂因素纳入考量[32,35]。

同步放化疗后四氢脱氧皮质酮呈下降趋势（图3f），提示类固醇代谢改变；但该结论仅依托少量映射代谢物，生物学意义尚不明确，解读需谨慎[30]。

综上，同步放化疗会引发机体代谢重塑，并伴随全身炎症、细胞应激应答；本文所有生物学机制解读仅用于提出科研假说，并非确定性结论。

基于氢气已知的抗氧化、细胞保护作用，本研究进一步对比氢气吸入组与单纯放化疗组的代谢组差异[2-5]。有趣的是，KEGG通路映射仅在氢气组得到一条单一代谢物匹配通路，提示嘌呤代谢可能参与氢气干预应答（图4c）。虽然该通路仅依托尿酸分子注释，但嘌呤代谢本身与抗氧化防御、细胞应激调控直接相关。氢气组代谢波动幅度整体更轻微，这一现象可解释为氢气部分缓解了同步放化疗诱发的机体异常生物学应答[20,32,35-38]。

同步放化疗后氢气组尿酸仍出现下降（图4d），说明即便辅以氢气吸入，放疗化疗诱发的嘌呤代谢紊乱仍可被检测到[20,22,32]。但两组代谢分析均为组内自身前后对比，横向组间直接对比有限，解读组间代谢差异需保持审慎。

两组同步放化疗后尿酸均下降，但氢气组下降幅度更小（图3e、图4d），该现象可佐证氢气部分缓解治疗相关氧化应激与下游代谢紊乱。为验证该观察结果，本研究对比两组尿酸自身前后差值；氢气组尿酸降幅数值更低，但组间差异无统计学意义（P=0.11，表6）。因此该结果仅为探索性发现，无法证实氢气存在特异性代谢调控作用。

值得一提，氢气组尿酸降幅减小与中度毒性发生率更低的现象同步存在，但二者不存在直接因果证据，仍需大样本、检验效能充足的前瞻性试验验证。

总体代谢组结果证实，同步放化疗会诱发全身代谢重塑。通路层面解读仅作提示参考：多数通路仅依靠单个或少量代谢物完成映射，仅用于提供生物学背景，不能证实通路整体发生显著扰动。氢气吸入带来的额外代谢调控效应仍有待进一步验证——本研究未开展完整组间代谢图谱横向对比，仅针对尿酸单一分子做差值对比，且组间尿酸差异无统计学意义[22,34,38,39]。

解读本代谢组数据时，同时需结合氢气生物学机制领域尚存的学术争议。现有理论认为氢气通过选择性中和高活性氧化剂减轻氧化损伤，但氢气的保护效应无法完全依靠直接清除自由基解释[3-6]。越来越多临床前研究与有限临床证据提示，氢气还可通过调控氧化还原信号、炎症应答、线粒体功能、细胞应激适应发挥生物学活性[4,5,7-9]。现阶段氢气仅可作为潜在辅助支持手段，不能视作广谱放射防护方案。

后续需开展大样本前瞻性试验，整合全面代谢组分析与临床终点指标，阐明氢气的分子机制，明确代谢改变是否对应临床可见的治疗毒性下降，且不削弱肿瘤控制效果。

本研究存在多项局限性：

1. 样本量偏小，检验效能不足，结论外推性有限，需更大独立队列完成验证；

2. 患者原发肿瘤部位、分期、化疗方案、基线个体特征异质性较高，可能干扰代谢应答与治疗毒性；两组基线化疗方案无统计学差异，但氢气组使用卡铂患者占比略高。顺铂与卡铂毒性谱不同，对全身代谢的调控作用存在差异，该基线不均衡为潜在混杂因素。尽管两组基线资料整体均衡，仍无法完全排除残余混杂干扰，临床与代谢组结果解读需谨慎；

3. 代谢分析仅分别开展各组内治疗前后自身对比，仅针对尿酸单一分子完成组间横向差值比较，氢气吸入特异性代谢效应尚不明确，需在大样本独立队列中开展完整组间代谢组对比加以验证；

4. 通路解读均为探索性结论，多数通路仅匹配1个或极少数代谢物，仅用于生成科研假说；嘌呤代谢通路注释完全依托尿酸，进一步限制机制推导可靠性；

5. 为降低非生物学干扰，解读时剔除外源性物质与未鉴定代谢物，该操作也缩小了通路覆盖范围；

6. 代谢组检测仅采用电喷雾正离子模式，多种有机酸等偏好负离子电离的代谢物检出不足；尿酸主要在负离子模式下检出，因此本研究尿酸定量结果稳健性有限；现有代谢数据集无法完整捕获全部治疗相关代谢改变，后续试验需同时采用正负离子模式，实现更全面的代谢组覆盖；

7. 未同步检测标准品，且未使用碰撞横截面积（CCS）辅助代谢物注释，文中所有差异代谢物均为推定注释，解读需审慎；

8. 多种代谢物仅在本组数据内表现出区分能力，未开展外部独立队列验证；ROC曲线基于筛选代谢物的同一数据集构建，报告的区分效能存在乐观偏倚，需外部队列校正；

9. 置换检验仅证明OPLS-DA模型组内区分稳定，样本量小、无外部验证仍存在模型过拟合风险，多元统计结果需谨慎解读；

10. 基线体成分、营养状态、水化水平、肾功能、固有放射敏感性等个体差异，加上氢气每日单次固定时长吸入方案，均可能干扰全身代谢图谱、治疗耐受性，以及可检测到的代谢调控幅度。

后续需开展多中心、大样本前瞻性临床试验，设置多时间点纵向采血、完善组间代谢组横向对比、增加外部验证队列并配套机制实验，明确同步放化疗期间辅助氢气吸入的生物学价值与临床意义。

 5 结论

局部晚期头颈部肿瘤患者同步放化疗期间使用氢气吸入整体耐受性良好，且中度治疗相关毒性发生率数值更低；但本预试验设计未评估肿瘤学远期结局。非靶向血清代谢组检测发现，联合氢气吸入后，嘌呤代谢、脂质通路相关代谢物出现探索性改变；尿酸是核心治疗相关代谢分子，可反映同步放化疗期间氧化应激介导的代谢应答。

氢气干预组尿酸下降幅度数值小于单纯同步放化疗组，但两组尿酸自身前后变化的横向对比无统计学差异。上述结果支持假说：辅助氢气吸入可轻度改变同步放化疗期间氧化应激相关代谢应答。但所有通路注释仅依托少量映射代谢物，各代谢物区分效能未经过外部队列验证，相关发现仅可用于提出研究假设，不能作为确定性结论。同时本研究样本量偏小、患者人群异质性高，结论推广价值受限。仍需扩大独立队列样本量，开展完整组间代谢组对比分析进一步验证。

Figure 2. Multivariate statistical analysis. PCA (a), PLS–DA (b) and OPLS–DA (c) score plots comparing serum samples from LAHNC patients collected pre-and post-CCRT (Group A). Permutation testing (n = 2000) confirmed the robustness and validity of the OPLS–DA models for Group A is shown in (d). PCA (e), PLS–DA (f) and OPLS–DA (g) score plots comparing serum samples from LAHNC patients collected pre-and post-CCRT combined with H2 gas inhalation (Group B). Permutation testing (n = 2000) confirmed the robustness and validity of the OPLS–DA models for Group B is shown in (h).

Figure 3. Metabolomic alterations in serum samples collected before and after concurrent chemoradiotherapy (CCRT). (a) Volcano plot showing significantly differential metabolites between pre- and post-CCRT samples. Red and blue dots indicate significantly upregulated and downregulated metabolites, respectively, while black dots represent non-significant metabolites. (b) Variable importance in projection (VIP) scores of the top 15 discriminative metabolites identified by OPLS–DA analysis. (c) KEGG pathway mapping of differential metabolites, illustrating single-hit pathway assignments that provide biological context for the observed metabolite alterations rather than definitive pathway-level perturbations. Representative box plots showing significantly altered metabolites, including ornithine (d), uric acid (e), and tetrahydrodeoxycorticosterone (f), between pre- and post-CCRT groups. Data are presented as normalized peak areas with FDR-adjusted p values indicated above each comparison.

Figure 4. Metabolomic alterations in serum samples collected before and after concurrent chemoradiotherapy (CCRT) combined with H2 gas inhalation. (a) Volcano plot showing significantly differential metabolites between pre- and post-CCRT combined with H2 gas samples. Red and blue dots indicate significantly upregulated and downregulated metabolites, respectively, while black dots represent non-significant metabolites. (b) Variable importance in projection (VIP) scores of the top 15 discriminative metabolites identified by OPLS–DA analysis. (c) KEGG pathway mapping illustrating an illustrative single-hit pathway assignment based on the differential metabolite uric acid. This mapping is intended to provide biological context rather than definitive evidence of pathway-level perturbation. (d) Box plot showing normalized peak area of uric acid in pre- and post-CCRT combined with H2 gas samples. Uric acid levels were significantly decreased following treatment (FDR-adjusted p = 4.5 × 10−3), suggesting alterations in purine metabolism potentially associated with treatment-related oxidative metabolic responses.

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