第一部分：富氢水减轻睡眠呼吸暂停模型鼠血管损伤1

第二部分：氢气预防间歇呼停血管损伤研究细节 2

第三部分：间歇性缺氧对内皮功能的影响及富氢水的作用

第四章 氢水治疗阻塞性睡眠呼吸暂停血管损伤的研究【讨论】

与女性相比，男性中阻塞性睡眠呼吸暂停（OSA）的相对患病率为1.5:1。这一数据首次在一项具有里程碑意义的威斯康星州睡眠队列研究中报道，该研究包括352名男性和250名女性（年龄在30至60岁之间），其中24%的男性和9%的女性患有OSA284。Franklin等人的一项研究鉴定了十一个基于人群的流行病学研究，并定义了OSA的平均患病率，男性为22%，女性为17% 285。后续研究表明，男性的平均患病率为27.3%，女性为22.5% 286,287。这些一致的证据表明，OSA在男性中比女性更常见，这促使我们只在我们的研究中使用了雄性C57Bl/6小鼠。我们的研究采用了之前研究中使用的方法，将小鼠安置在定制的间歇性缺氧笼子中（由Slava Savransky设计的HyCon系统），每分钟经历一次最低氧水平为5-6%的30秒288,289。这个小鼠模型允许实验室调查一些睡眠呼吸暂停的变化，包括内皮功能障碍、心血管异常、免疫障碍和肾脏疾病52,290,291,292,293。western blot结果显示，与间歇性缺氧组相比，间歇性常氧组小鼠的HIF-1α表达显著更高（p < 0.005），这表明暴露于间歇性缺氧8周的小鼠正在经历低氧水平。然而，间歇性常氧组与间歇性缺氧组之间的平均差异与先前报告的不同，后者的HIF-1α高出约2.9倍294。这可能是由于方法学上的差异，因为我们的研究中使用了三步高灵敏度的western blot。生物素偶联的二抗和HRP偶联的链霉亲和素极大地放大了信号，同时也提高了检测水平，这可能解释了在间歇性常氧组中出现的条带，导致对间歇性缺氧动物的HIF-1α水平的低估，并减少了间歇性常氧组与间歇性缺氧组之间的绝对差异。小鼠被随机分配到四个组，并安置在PDC（临床前发现中心，UBC）。研究开始时，被分配到IHRW组的小鼠的平均体重略低于其他三组，但四组之间没有显著差异。

间歇性缺氧组的小鼠体重增长（第8周与第0周相比）低于间歇性常氧组，然而四组之间在体重增长上没有统计学上的显著差异。尽管OSA患者由于胃饥饿素水平较高，比同等体重但无OSA的人群更易增重295，但众多研究报告称，低氧会导致体重减轻并降低代谢综合征的风险296,297,298,299。近期研究表明，间歇性缺氧可作为辅助治疗手段增加肥胖患者的减重效果，且当与运动结合时，可实现额外的减重300,301。低氧可能通过减少能量摄入和增加能量消耗来导致体重减轻302。但其机制细节尚需进一步研究。OSA被视为一种慢性轻度炎症性疾病。作为最重要的炎症标志物之一及炎症免疫系统的优秀代表，血浆IL-6水平在OSA中较健康对照组更高，这一现象在动物和人类研究中均有发现303。MCP-1在炎症过程中吸引单核细胞和巨噬细胞304。一项荟萃分析表明，OSA患者的血浆MCP-1水平显著高于对照组，且MCP-1的值随着OSA的严重程度增加而增加305。然而，在我们的研究中，间歇性常氧组与间歇性缺氧组之间的IL-6和MCP-1的差异不显著，p值在0.05至0.1之间。HRW降低了暴露于间歇性缺氧动物的IL-6和MCP-1水平，但这种差异在统计上不显著。这可能是由于分析中包含的样本量小所致。未来的研究需要更大的样本量。此外，间歇性常氧组与间歇性缺氧组之间的血浆IL-10水平没有主要变化，这与之前的研究结果一致，表明IL-10与OSA无关306。低氧会增加活性氧物种（ROS）的水平并促使包括DNA、脂质和蛋白质在内的生物分子发生氧化。氧化性DNA损伤导致形成8-OHdG，这是由OH·自由基与DNA中的鸟嘌呤环结构反应形成的。脂质过氧化导致形成8-异前列腺素。在我们的研究中，低氧显著增加了8-OHdG（p < 0.01）和8-异前列腺素（p < 0.001）的水平。HRW处理降低了这两种标记物的浓度（分别为p < 0.1和p < 0.01）。有趣的是，这两种氧化应激标记物的水平在常氧组中经HRW处理后略有增加。在新生缺氧缺血大鼠模型中，通过吸入氢气2小时也报告了氧化应激的增加307。我们研究中8-OHdG的增加约23%，小于每天吸烟15-20支烟导致的53%增加，并且低于某些疾病如前列腺癌（63%）309、膀胱癌（95%）306、II型糖尿病（335%）310和I型糖尿病（355%）307。常氧组中经HRW处理后8-OHdG的增加与一次剧烈运动后的增加相当，其中30公里/天跑步8天后尿液中的8-OHdG增加了26%311。帕金森病患者经氢气吸入治疗4周后，尿液中的8-OHdG也有轻微增加312。与疾病相关的持续8-OHdG增加不同，运动对8-OHdG的影响是暂时的，观察到在自行车测力计上以最大氧气摄取量的70%进行60分钟的运动后第二天，升高的尿液8-OHdG水平恢复到基线水平313。我们在治疗结束后没有收集样本。氢气的快速消散意味着其瞬时效应，动物只是暂时暴露于轻度增加的ROS314。轻度增加ROS被假设通过引发hormesis提供有益效果，这描述了有害物质在低浓度下刺激有益效果的过程315。运动诱导的ROS在介导运动训练的好处和细胞适应方面起着关键作用。运动通过轻度增加ROS形成改善II型糖尿病患者的胰岛素抵抗，补充抗氧化剂会减少运动的健康益处316,317。这让我们假设HRW模仿运动介导的暂时性轻度增加ROS并具有类似的好处。急性运动增加了年轻运动员血液中的氧化应激标记物，而预先一周的HRW给药温和地增强了ROS水平的增加，同时减少了血液乳酸水平并降低了运动引起的肌肉功能下降318。氢气增强了外科损伤小鼠大脑中的脂质过氧化，同时改善了脑水肿和神经行为评分319。同样，在我们的研究中，HRW提高了常氧组中的血浆8-异前列腺素和尿液8-OHdG水平，同时改善了血管功能，包括Ach诱导的最大血管舒张和基础NO释放。

间歇性缺氧相关的内皮功能障碍已在包括主动脉、脑动脉和肌肉动脉的啮齿动物血管床中被报告。OSA中导致内皮功能障碍的因素有很多，如ADMA增加、ROS增加和抗氧化能力下降（图4.1）。损伤的严重程度由氧气最低水平和IH暴露的持续时间决定。虽然CPAP治疗可以显著提高OSA患者的绝对流量介导的扩张（FMD）323，但对治疗的依从性限制了改善的程度324。在健康受试者饮用单剂量HRW后30分钟内观察到肱动脉FMD的显著改善271。然而，HRW在OSA中的长期疗效尚不清楚。我们的数据证实，缺氧导致内皮功能障碍，表现为对Ach反应的血管松弛减少。与对照组相比，响应10^-5 Ach的最大血管舒张（Emax）显著降低，从大约80%降至60%（p < 0.005），而HRW治疗通过将Emax改善至约75%，这与对照组没有统计学上的显著差异。常氧组和缺氧组的内皮非依赖性血管舒张相似（p > 0.05）。NO在维持血管基础舒张张力方面起着重要作用325。我们的研究表明，与IARW相比，IHRW中NO的基础释放减少（p < 0.05）。除了NO基础释放减少外，我们还观察到IHRW对10^-5M PE的收缩增加。HRW治疗恢复了NO的基础释放（IHHRW vs. IHRW p < 0.05），并将血管收缩减少到对照组水平（IHHRW vs IARW p>0.05）。NO是由内皮一氧化氮合酶（eNOS）形成的，它将L-精氨酸转化为NO326。我们发现，与IARW相比，IHRW中eNOS的内源性抑制剂ADMA水平增加（p < 0.01），并且通过HRW治疗减少（p < 0.01）。有报告称，暴露于缺氧的动物以及严重OSA患者中SOD2、GPx-1和GPx-4的表达减少327,328,329,330,331,332。我们的研究显示，暴露于缺氧的小鼠中SOD2和GPX-4的表达减少，但GPx-1未减少。由于我们研究的样本量小，可能未观察到统计学意义。一些研究提出，氢气可能激活核因子红细胞2相关因子（Nrf2）通路，并通过诱导Nrf-2依赖的抗氧化基因如SOD和GPx来减轻伤害333,334,335。与仅接受缺氧处理的小鼠相比，接受HRW处理的小鼠GPx-4表达增加。GPx-4与其他谷胱甘肽过氧化物酶不同，它是唯一一个能降解脂蛋白和复杂脂质中发现的氢过氧化物的亚型，如胆固醇、胆固醇酯和磷脂衍生物336。在用HRW处理的缺氧小鼠中GPx-4表达增加，与体内自由基催化的花生四烯酸（一种存在于细胞膜磷脂中的多不饱和脂肪酸）过氧化产生的8-异前列腺素水平下降一致。与预期相反，HRW处理后SOD2水平降低而非改善，这可能是由于我们研究的样本量小。Ishihara等人的一项研究报告称，氢气可能作为电子流动的调节器影响线粒体膜电位，从而抑制线粒体生成的超氧化物337。在Ishihara等人的研究中，通过测量由超氧化物转化而来的H2O2来估计线粒体中的电子泄漏。为了观察H2对细胞电子流的影响，通过向从人类肺细胞系分离的线粒体中添加5 mM NADH，将NAD+/NADH比率设定为200。在5 mM NADH存在下，琥珀酸（RET的底物）的反向电子传输（RET）转变为正向电子传输（FET），从+1.62 ± 0.358 mM变为-1.83 ± 0.191 mM，并伴随着51.1%的超氧化物生成被抑制。SOD2催化两个超氧化物分子反应形成一分子氧气和一分子过氧化氢。因此，随着线粒体中超氧化物的减少，对SOD2的需求也可能减少。

未来研究方向：需要更多的研究来进一步理解OSA相关因素，并为IH及其治疗提供更好的见解。

1. 基础NO合成维持静息血管张力，然而超氧化物可以与NO相互作用并使其失活，产生有毒的过氧亚硝酸盐（ONOO-）。虽然超氧化物可以被超氧化物歧化酶（SOD）还原为H2O2，然后被过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶消除，但超氧化物与NO之间的反应速率比SOD对超氧化物的歧化快三倍（6.7 × 10^9 mol/L^-1s^-1）338。硝酪氨酸的形成代表了一种特定的过氧亚硝酸盐介导的蛋白质修饰。检测硝酪氨酸作为内源性过氧亚硝酸盐活性的生物标志物是评估内皮功能障碍的重要组成部分339。

2. 非偶联eNOS被认为是导致内皮功能障碍的最重要机制之一。它指的是eNOS产生超氧化物而不是NO的情况，因此成为有害自由基的来源，而不是抗动脉粥样硬化的NO340。此外，NADPH氧化酶是血管中超氧化物的主要生产者，被认为是触发额外ROS源激活的“引燃自由基”的主要来源，例如通过eNOS非偶联341。在实验模型中，NADPH氧化酶的表达和活性已被报告增加，如糖尿病342,343、高血压344,345、吸烟346以及肥胖347,348，以及冠心病患者349,350。对eNOS非偶联进行染色并研究NADPH氧化酶可能为OSA中的内皮功能障碍及HRW的益处提供额外的见解。

3. 阐明Nrf2通路与HRW保护效应之间的联系。除了SOD和GPX外，Nrf2调控的下游基因还包括血红素氧合酶1（HO-1）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）等。除了评估抗氧化酶的表达外，还需要关注酶活性。

4. 比较IH和HRW治疗对不同组别之间端粒长度的影响。结合端粒长度和衰老生物标志物进行分析，可能提供对OSA相关老化和HRW潜在作用更全面的理解。

5. 设计一个实验，让小鼠在开始HRW治疗前暴露于IH较长时间，如8周。结果将反映HRW是否能逆转IH引起的内皮功能障碍、氧化应激、全身炎症和小鼠的老化。

本研究局限性

使用动物模型排除了诸如已有的高血压、糖尿病和肥胖等混杂变量的影响，这些是人类研究中的潜在变量。这种IH小鼠模型在文献中已被广泛讨论，特别是在阐明OSA相关心血管代谢并发症方面。我们的数据显示，HRW治疗通过增加基础NO、降低ADMA、氧化应激和炎症来改善缺氧下的内皮功能障碍。然而，我们的研究也有局限性。大多数啮齿类动物研究只使用雄性动物以避免雌激素对药物效果的影响。但是性别差异确实存在且不能被忽视。在阿尔茨海默病（AD）发病机理的小鼠模型中，展示了HRW的新颖性别特异性益处351。连续3个月给予HRW（0.1 ml/10 g，b.i.d.）逆转了AD动物大脑中雌激素水平的下降（p < 0.05），并在雌性转基因AD小鼠中增加了雌激素受体β和脑源性神经营养因子表达（p < 0.05），但在雄性AD小鼠中则没有335。此外，HRW在雌性AD小鼠的大脑中更深刻地改善了氧化应激和炎症反应335。由于生物学性别和社会性别的差异可能影响病理发生和治疗反应，HRW可能在男性和女性中表现不同，这已在许多疾病中被观察和报告。因此，未来研究应包括雄性和雌性啮齿类动物，并且在分析啮齿类动物和人类的研究时进行亚组分析将是有用的。此外，啮齿类动物比人类代谢大多数分子的速度要快得多。啮齿类动物通常接受的分子剂量比人类大，人类与小鼠之间的比例为12.3，而大鼠为6.2352。然而，与大多数分子不同，氢在细胞中的半衰期和实际浓度在啮齿类动物和人类中是相似的。在啮齿类动物模型中使用的HRW浓度大致范围从0.35到2.0 mmol/L，而在人类中的范围是从0.5到1.9 mmol/L。这些值是可比的并有一定程度的重叠，似乎符合合理的结论，即啮齿类动物和人类预期将接受类似的氢剂量，因为细胞内浓度相似。因此，我们在研究中每4-6小时更换一次HRW，以保持氢浓度在0.5 mmol/L以上。然而，由于啮齿类动物和人类在单位体重的水消耗量上有巨大差异：一只25g的小鼠每天大约消耗4mL水，一只大鼠可能需要每天10到12mL的水每100g体重，而一个80kg的人建议每天消费3.2L（女性2.7L，男性3.7L），相当于每100g体重16mL对于小鼠，10-12mL对于大鼠，以及4mL对于人类。如果仅考虑简单计算，小鼠和大鼠每天的水量消耗分别是人类的大约4倍和2.5-3倍。但这变得更加复杂，因为大多数人类研究通常每天消费300mL到1L的富氢水，而啮齿类动物则随意提供HRW。因此，当提供相同浓度的HRW时，小鼠相对于体重接收大约12.8到42.67倍更多的H2暴露，而大鼠接收8到26.67倍更多的H2。考虑到物种间H2暴露的巨大差异，提倡减少啮齿类动物中的H2暴露浓度，并在后续实验设计中计算相对剂量，以更好地比较啮齿类动物和人类的数据，推进转化研究。在啮齿类动物中一次性口服高浓度HRW是一种模拟人类HRW消费的可行方式。

（这部分分析说明作者对气体的体内运转存在误解，气体在体内的运输受到动物身体质量非常大的影响，例如小鼠体内气体运输速度比大鼠快很多，人体因为体积非常大，气体运输速度变很慢，设想大象，吸一口气体，到达全身各个部位会比小鼠慢许多倍。只根据体重计算剂量是非常错误的做法。希望从事氢气医学研究的学者一定要避免这种错误认识。当然氢气和其他许多气体特别是氧气存在非常大差异，是因为这种气体扩散能力实在太大，在血液循环运输中，跨血管逃逸速度很快，导致远离心脏的器官组织，随着距离增大，送达效率迅速下降。例如足部组织，采用氢气吸入的方式，几乎没有任何价值。因为氢气几乎永远无法送达。这里最好采用局部氢气敷，或氢水湿敷的方法会更好。你明白了吗？）

总结

OSA的发病率持续上升，但大多数OSA患者仍未被诊断出来。传统的疗法如CPAP昂贵，且在预防心血管疾病方面效果有限，因为患者的依从性差。需要寻找提高依从性、更方便有效的替代疗法。本论文的结果识别了HRW在改善OSA小鼠内皮功能障碍和减少炎症的潜在用途。