原位3D生物打印的再生细胞疗法

再生医学通过将可存活的细胞注入、移植或植入患者体内，以期发挥预期的治疗效果，如创伤性伤口的愈合。然而，高效地将治疗性细胞送达目标部位而不损失其生存和功能，并确保组织整合是成功的关键挑战之一。因此，要充分发挥细胞疗法在再生医学中的潜力，采用、适应或开发更好的工具来通过各种生物制造技术生产高质量的基于细胞的产品是有益的。

传统的再生细胞疗法通常涉及将细胞悬浮在一种液体中，通过注射器针头或导管直接在目标部位进行体内注射。尽管这种方法简单，但临床结果却不尽人意，部分原因是注射的细胞未能保持在目标部位。为了解决这一限制，一旦被传递就不太可能解体的大型载细胞模块已成为一个有吸引力的替代品。无定形可注射水凝胶生物材料无疑是最常见的作为治疗性细胞载体的配方（1）。替代方案包括装有细胞的预成型模块化结构，如微凝胶和多孔聚合物微球（2）。

这些方法面临着几个缺点，包括与原生组织相比不可避免地减少的细胞密度，以及人工引入的生物材料与原生细胞外基质（ECM）和组织结构的不同组成和空间组织。这样的缺点促使了使用不含生物材料的高密度细胞构建物的使用。例如，以平板（3）或三维（3D）排列方式递送的细胞，如球体（4），在临床前研究和临床试验中在再生目标组织方面取得了不同程度的成功。

尽管如此，无论是采用富含生物材料的还是不含生物材料的模块化构建物，它们几乎总是在注射后随机堆积成不规则的结构。这可能对许多细胞治疗场景来说是可以接受的，但对于需要与治疗部位的原生几何形状相符合的一些应用来说，细胞组织的缺乏可能证明是不足够的。例如，在皮肤损伤或肌肉丢失的情况下，匹配组织架构以达到结构、功能和美观效果是很重要的。

为此，出现了一些具有精确时空模式化细胞和生物材料的生物制造方法。沿着这些线索，添加式生物制造有能力生成与其原生目标组织几何形状相近的微尺度和宏尺度载细胞构建物（5）。更常被称为3D生物打印的方法有多种模式。

一种广泛使用的方法是挤出生物打印，它使用喷嘴逐点逐层地将生物墨水（细胞加上其他必要的结构和活性成分）沉积到收集板上，并且经常使用多种生物墨水（6）。其他经常采用的生物打印方法有喷墨生物打印（7）和光聚合生物打印（8）。喷墨生物打印将微小的生物墨水液滴喷射成精确的图案，而光聚合则使用一个或几个预先装有生物墨水的容器，通过光化学（单光子和多光子）（8）或声化学（9）产生3D构建物。

到目前为止，添加式生物制造在很大程度上依赖于使用生物材料来实现组织架构的体积结构和塑形。最初将生物打印与不含生物材料的高密度细胞模块相结合以确保类似自然的细胞-细胞相互作用的演示，专注于将多细胞球体偏斜到图案化针阵列上。在这种方法的后续版本中，使用了吸气式微喷嘴来一个接一个地转移球体，以叠加成体积图案，无需偏斜针（6）。

最近的主要发展允许精确构造不含生物材料的细胞聚集体，形成与简单添加球体相比分辨率和复杂性有所提高的组织相关图案（6）。例如，仅由体细胞颗粒组成的生物墨水可以装入生物打印喷嘴并挤出成为纯细胞的细丝。然后通过将纯细胞生物墨水挤入支持性水凝胶浴中赋予其图案化能力。值得注意的是，当结合仅含干细胞的无生物材料生物墨水与挤出生物打印时，可以产生具有明确时空排列的类器官。这些生物打印的类器官在体外显示出比传统的仅通过细胞自组装产生的球形类器官更好的一致性、分化效率和组织形成表现。

大多数人类固体器官展现出每立方厘米几十亿细胞的高密度排列。这种排列对于它们的复杂功能和结构完整性至关重要。例如，人类肝脏具有密集的细胞排列，这对于其代谢和解毒活动是必需的。同样，心脏组织表现出紧密堆积的细胞，这反过来确保了有效的电导性和收缩力以调节泵血。因此，模仿这些高细胞密度的生物打印组织预计将通过提供协同细胞相互作用、信号传递和移植后的组织整合，大幅增强再生细胞疗法的结果。

直到现在，将添加式生物制造与不含生物材料的高密度细胞生物墨水的结合依赖于使用台式生物打印机，这意味着必须先制造组织，成熟到分化表型，然后再进行移植。通过将传统的添加式生物制造方法转变为原位生物打印，这一过程可以得到进一步改进。这种方法涉及直接在患者体内的目标部位图案化生物墨水，允许在实际需要再生或修复的生理位置内精确构建匹配部位的组织结构（10）。因此，原位生物打印可能会允许更高的适应性；降低污染风险；更简化的程序；以及改善细胞存活率、功能、宿主整合和美观外观。因此，原位生物打印不仅可以在医院环境中增强伤口再生，而且在紧急情况下，如战场上急需快速包扎时，也可能极为有益。

原位生物打印方法和生物墨水的多样性

已经开发了直接应用于外科设置的原位生物打印技术。技术范围从适应传统台式生物打印机与喷嘴，如挤出和喷墨模型，到使用光或超声波作为成形能源源的光聚合方法。当前技术使用富含生物材料的生物墨水——导致细胞浓度稀释和生理相关性降低。使用由单细胞颗粒、球体或类器官形成干细胞组成的不含生物材料的富细胞生物墨水，可以大幅增强原位生物打印在再生医学中的治疗效果和临床适用性。

Regenerative cell therapy with 3D bioprinting | Science

原位生物打印涵盖了几种不同的方法（10）。一种是使用传统的生物打印机，如直接在外科手术过程中应用（8, 11）。另一种方法是将打印头微型化，使其能够安装在手持设备中，从而允许外科医生指导的手动绘制治疗部位（12）。这种方法将实现快速可调和用户定义的3D图案形成。或者，编程机器人操作的基于导管的生物打印机也可以实现治疗性细胞生物墨水的结构化递送（13）。一些采用这些方法的临床研究已经在计划中（见图）。

值得注意的是，原位生物打印的先前演示完全集中在利用富含细胞的生物材料生物墨水上。然而，将包含类似天然组织细胞密度的生物墨水与原位生物打印结合可以提高性能。这种组合的一些初步例子采用了微凝胶作为构建块，这些微凝胶中充满了高密度的细胞。这些微凝胶被预培养以形成目标细胞密集的小组织，然后作为生物墨水聚集体加载到原位生物打印机中。使用机械臂使能的原位挤出方法实现了大鼠颅骨缺损的体内愈合（14），喷墨生物打印机修复了小鼠体内的肌肉和皮肤缺损（15）。这些研究还表明，以预定模式原位递送的高密度小组织块可以比简单、无结构的相同高密度微凝胶部署更快地促进愈合。

展望未来，预计当原位生物打印开始包含真正不含生物材料的生物墨水，只含有单个细胞或其聚集体（球体或类器官）时，可能会释放再生医学的全部潜力。这是因为当最小化使用生物材料（其组成和精细结构经常在某种程度上与天然组织不同）时，生物打印构造中的高密度细胞将有机会通过组织成熟过程形成更强大的细胞间相互作用。这个成熟过程还允许细胞形成它们自己的特定于组织的、分层组成的、精细结构的ECM，否则无法通过人工引入的生物材料精确模仿。此外，当干细胞以所需的密度原位生物打印以模拟早期发育阶段组织的形态时，可能达到易于增强再生的高度功能性替代组织。值得注意的是，与之前仅通过简单注射实现的随机架构相比，满足局部组织确切的结构、功能和美观需求的高密度细胞聚集体将成为可能。

将原位生物打印与不含生物材料的高密度细胞生物墨水结合用于再生医学的细胞疗法并非没有挑战。与图案化富含生物材料的生物墨水不同，生物打印高密度模块需要与周围组织微环境适当粘合。此外，需要在模块内部维持内聚力，这可能并不简单，需要额外的设计考虑，例如加入促进细胞间相互作用以形成整体组织块的生长因子。而且，尽管针头注射是微创的，但使用原位生物打印机可能会导致稍微更具侵入性的程序，具体取决于所使用的特定方法。因此，必须对仪器进行精心工程化，可能需要利用最先进的显微外科设备和医疗成像平台。

原位要生物打印的图案需要匹配特定的组织需求，例如，对于肌肉来说将是单向排列，而对于肝脏则是重复的叶状单位。为此，用原位技术精确构建高密度细胞生物墨水的结构可能并不简单，可能需要进一步改进仪器，如可能与人工智能驱动的算法集成。另一个有趣的探索领域可能是包括合适的线索，如趋化因子、基因编辑工具、治疗性分子或其他生物活性剂，以在原位生物打印后在治疗部位实现定向的细胞修改或分化，否则在没有预成熟步骤的情况下可能在体内带来风险。这种方法可以通过使用聚合物纳米颗粒、合成人工干细胞或胞外囊泡来实现这些试剂的受控释放，同时仍保留最少的外源性生物材料。最后，鉴于该技术的早期阶段，需要进行广泛的临床前和临床研究来解决这些挑战和安全问题，然后才能应用于转化医学。