膜蛋白表达又双叒叕翻车了？多次改造载体、反复调试诱导条件，到头来还是蛋白沉淀、低产量、无活性，下游实验也迟迟推进不了。膜蛋白独特的疏水跨膜结构，常规可溶性蛋白表达体系难以适用。本文梳理各类膜蛋白表达难点，对比 VLP、去垢剂、纳米盘、无细胞表达等制备平台，帮你快速选定适配方案，避开实验踩坑。

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膜蛋白分类

膜蛋白 (Membrane proteins) 是维系生命活动至关重要的核心功能单元，参与细胞信号传导、物质跨膜转运等关键生理过程^[1][2]。在人类基因组里，约 30% 序列编码膜蛋白；超过六成上市药物以膜蛋白为靶点，是新药研发的热门方向^[3][4]。生物学上，将与磷脂双分子层相结合、定位于生物膜区域的蛋白统称为膜蛋白。按照与细胞膜的结合形式及功能特点，膜蛋白可分为三类：外周膜蛋白、整合膜蛋白、脂质锚定膜蛋白 (图 1)^[5][6][7]。

                                                                                                     图 1.膜蛋白分类示意图^[5]。

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跨膜蛋白表达难点

综合上述分类特征可以发现：外周、脂质锚定膜蛋白无贯穿膜层的跨膜区，整体水溶性强，常规表达体系即可制备；单侧整合膜蛋白疏水区域少，制备难度也较低。而跨膜蛋白完整穿透磷脂双层，拥有疏水跨膜区，结构复杂，长期以来都是重组表达、靶点药物开发中的一大难题。以下为跨膜蛋白表达时遇到的各类核心问题。

 

难点 1｜疏水跨膜区极易聚集沉淀

膜蛋白本质是两亲性分子：胞外、胞内区亲水，跨膜区由 20–30 个疏水氨基酸组成^[8][9]。在细胞膜里，脂双层可包裹疏水区域防止聚集；体外环境下疏水区域暴露，蛋白极易沉淀，难以纯化。因此，纯化时一般需添加去垢剂包裹跨膜区，模拟磷脂环境，稳定蛋白构象、避免聚集。

 

难点 2｜过表达引发宿主毒性

过量表达膜蛋白会占用细胞内膜转运通路，破坏细胞膜结构并诱发宿主应激，从而导致细胞生长受阻、蛋白产量下降，甚至细胞裂解^[10][11]。针对这种毒性问题，蛋白表达时可选用耐受菌株、低温弱诱导方案，或采用无细胞表达体系从根源规避影响。

 

难点 3｜跨膜结构复杂，折叠困难

跨膜蛋白依靠跨膜区嵌入磷脂双分子层完成折叠、定向，并经翻译后修饰获得活性构象。异源宿主的膜环境、分子伴侣及修饰通路与天然体系存在差异，易引发蛋白折叠、定位缺陷^[12]。对此，可选用真核表达系统，搭配共表达分子伴侣、温和诱导的方式，降低错误折叠概率。

 

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多种膜蛋白表达平台

VLP 平台

病毒样颗粒 (VLP，Virus-like particle) 是由病毒骨架蛋白自组装形成，为不含病毒核酸的空心颗粒。通过共表达病毒骨架蛋白与目标跨膜蛋白，骨架蛋白在细胞膜内侧自发聚集，诱导膜向外凸起；跨膜蛋白随之富集，经膜出芽、脱落形成带有天然脂质包膜的 VLP，跨膜蛋白定向展示在包膜表面^[13][14]。VLP 组装依赖宿主的天然膜系统，无需去垢剂，蛋白处于天然磷脂环境，可以较好保留天然构象与活性。但出芽过程会携带其他宿主杂蛋白，样本背景偏高，不适合配体-蛋白互作实验。

图 2.VLP 组装跨膜蛋白的过程^[14]。

 

 

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参考文献：

[1] Vaitsopoulou A, et al. Membrane Protein Production in Insect Cells. Methods Mol Biol. 2022;2507:223-240.

[2] Peled-Zehavi H, et al. Membrane Protein Insertion in Cells: Principles, Pathways, and Quality Control. Chem Rev. 2026;126(11):6526-6549.

[3] Duart G, et al. Experimental and computational approaches for membrane protein insertion and topology determination. Methods. 2024;226:102-119.

[4] Young JW. Recent advances in membrane mimetics for membrane protein research. Biochem Soc Trans. 2023;51(3):1405-1416.

[5] Van Campenhout R, et al. Therapeutic Nanobodies Targeting Cell Plasma Membrane Transport Proteins: A High-Risk/High-Gain Endeavor. Biomolecules. 2021 Jan 6;11(1):63.

[6] Boulos I, et al. Exploring the World of Membrane Proteins: Techniques and Methods for Understanding Structure, Function, and Dynamics. Molecules. 2023 Oct 19;28(20):7176.

[7] Zhao X, et al. Precise Regulation of Membrane Proteins: From Physical Technology to Biomolecular Strategy. Adv Sci (Weinh). 2026 Feb;13(10):e10367. 

[8] Zhou Z, et al. Advances in solubilization and stabilization techniques for structural and functional studies of membrane proteins. PeerJ. 2025 Apr 4;13:e19211.

[9] Ryu H, et al. Biomimetic Membranes with Transmembrane Proteins: State-of-the-Art in Transmembrane Protein Applications. Int J Mol Sci. 2019 Mar 21;20(6):1437.

[10] Snoeck S, et al. "Metabolic burden" explained: stress symptoms and its related responses induced by (over)expression of (heterologous) proteins in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 2024 Mar 30;23(1):96.

[11] Gubellini F, et al. Physiological response to membrane protein overexpression in E. coli. Mol Cell Proteomics. 2011 Oct;10(10):M111.007930.

[12] Smalinskaitė L, et al. The Biogenesis of Multipass Membrane Proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2023 Apr 3;15(4):a041251.

[13] Hurley JH, et al. Inside job: how the ESCRTs release HIV-1 from infected cells. Biochem Soc Trans. 2018 Oct 19;46(5):1029-1036.

[14] 朱珊,等.病毒样颗粒的制备研究与应用进展[J].中国生物工程杂志,2025,45(Z1):68-79.

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