RNA生物农药技术层面需要解决的问题

依据目前的研发进度，RNA生物农药极有可能在未来几年上市。目前来看，RNA生物农药在技术层面上还有一些问题需要解决。

• 高效RNAi靶标基因的筛选  

RNA生物农药优势之一是利用低剂量dsRNA即能够引起高效RNAi效应，因此，获得目标生物高效致死的RNAi靶标基因是研制RNA生物农药的关键。

目前对于靶标基因的筛选和获得，可以通过（1）已知的病虫生长发育过程中的关键基因，作为可能的靶标基因进行筛选；（2）通过相近物种中已知的高效靶标基因的同源序列基因进行筛选；（3）通过测序技术，对病虫不同组织、不同发育阶段基因进行研究和筛选，从而获得高效致死作用的靶标基因。

目前，通过这些方式，已经获得多个重要害虫的靶标基因。但是，在筛选靶标基因的同时，也发现不同种类昆虫RNAi效率不同。比如，相比于鞘翅目、直翅目昆虫来说，鳞翅目昆虫RNAi效率较低，高效致死作用的靶标基因筛选也相对困难。这可能是由于昆虫自身特异基因、中肠环境、RNAi通路机制存在差异而导致的结果。那么，在针对这类昆虫靶标基因筛选时，就需要综合考虑。由于同一靶标基因在不同物种中行使的功能并不完全一致、不同作用机制的靶标基因可能产生抗性程度存在差异、不同物种中RNAi作用机制存在差异，而且都是影响靶标基因作用效果的重要因素，因此，在选择靶标基因的过程中均需考虑。

• dsRNA的生产成本

  
  

dsRNA的合成成本是RNA生物农药能否在田间施用的至关重要的因素。合成dsRNA的方式，主要包括化学合成、体外合成以及微生物发酵合成3种方式。

化学合成成本高，并且随着dsRNA合成长度的增加，合成错误率增加，一般仅适用于实验室研究的小剂量使用，而不适合大规模生产。

体外无细胞系统的合成方式主要通过表达dsRNA的元件，之后通过对合成体系进行调整优化，进行体外合成并纯化。目前，针对于这种合成方法，美国的Greenlight Biosciences公司研发了无细胞合成体系，能够将dsRNA的合成成本控制在1美元/g以内，其成本已经能够满足田间规模化应用的要求（https://greenlightbiosciences.com/）。

利用微生物发酵表达合成dsRNA也是目前可能规模化应用的方式之一。已经在包括大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在内的多种底盘细胞中构建并得到合成dsRNA的菌株，通过提取微生物发酵产物或者将微生物灭活后，处理相关的靶标生物，均能够产生相应的RNAi表型。例如加拿大Renaissance BioScience Corp公司通过专属的酵母载体表达dsRNA，饲喂马铃薯甲虫，能够精准地抑制靶标基因的表达，并且对马铃薯甲虫致死率高达98.3%，达到保护植株的功效（https://renaissancebioscience.com/）。

• dsRNA的稳定性 

dsRNA属于核酸类物质，在复杂的大田环境（pH、光照、雨水、微生物等）中或者存在核酸酶的情况下，极其容易发生降解。因此，RNA生物农药的稳定性及货架期对于RNA生物农药产品的开发至关重要。目前，已经有多种手段提高dsRNA的稳定性。例如，通过纳米包被，显著提高dsRNA的稳定性；通过BioClay的包被，能够显著提高dsRNA在叶片上的存在时长，增加喷洒型dsRNA的作用效率。同时，也有多家公司专门开展针对于dsRNA稳定性的各种助剂以及纳米颗粒研发，结果显示，添加各种辅助产品后显著增加dsRNA在环境及靶标生物体内的稳定性。

• 其他需要解决的问题 

除了上述几个主要问题之外，RNA生物农药的递送效率，RNA生物农药在进行环境风险评估时残留量的检测手段等等都是RNA生物农药应用之前亟需解决的关键问题。随着科研机构、相关企业以及投资机构对该领域的进一步深耕，相信这些问题能够迎刃而解，从而推动RNA生物农药的早日推广使用。

RNA生物农药的环境评估及政策层面需要解决的问题

RNA生物农药能否早日实现商业化应用，除了技术层面的问题之外，还面临着可能的环境及政策层面需要解决的问题。

RNA生物农药获得农药许可证书之前，需要进行环境风险评估。主要包括评估应用过程中释放的dsRNA在环境中的存在及降解情况，对于非靶标物种的影响，以及对于人类健康存在的可能风险。进行残留检查时，就需要运用合适的技术手段进行痕量dsRNA残留的检测。

对于dsRNA含量的检测，目前在实验室条件下主要采用分光光度计、琼脂糖凝胶电泳及PCR进行检测，需要相对专业的实验室环境。同时，由于不同检测方法的灵敏度存在一定差异，因此需要研发针对环境中的痕量dsRNA，进行简便、快速、高灵敏度的检测方法。目前，通过放射性同位素32P标记的方法，可以显著提高检测环境中dsRNA的灵敏度。

其次，对于非靶标物种的影响。除了采用传统的急性及慢性毒理检测手段之外，根据RNAi的作用机制，dsRNA仅对能够良好匹配的目标mRNA产生抑制作用。那么，能否利用生物信息学手段，对非靶标物种的整个基因组序列进行分析，预测目标dsRNA可能对于非靶标物种的影响，这种检测的可信度有多高，能否作为一种技术手段或者作为一种参考应用于RNA生物农药的环境毒理检测，也是需要深入探讨的重要问题。

关若冰，李海超，苗雪霞，RNA生物农药的商业化现状及存在问题，中国农业科学