代谢学人

Cell Metabolism:山雨欲来风满楼，脂肪产热谁拔头筹？

撰文 | 游俊丰 程诗淼 高铭远 生茂正 郭盈盈 于剑 

编辑 | 孟美瑶

校对 | 于剑

背景介绍

脂肪细胞能够通过多种途径消耗机体储存的能量同时通过线粒体氧化产生热量，因此脂肪细胞的代谢活动与机体代谢健康密切相关。机体的大部分组织器官都能够进行代谢产热，而其中棕色脂肪组织是产热能力最强的部位，大约可提供非颤抖产热总量的70%，因此棕色脂肪组织对动物在寒冷环境中维持体温至关重要。线粒体是细胞进行能量代谢的重要器官，线粒体中的呼吸链蛋白将质子泵入线粒体内外膜间隙，形成蕴含着大量电化学势能的质子梯度，接下来ATP合成酶利用质子梯度储存的电化学势能来合成ATP，这种将电子传递和ATP形成相偶联的机制称为氧化磷酸化，当机体受到冷刺激和β-肾上腺素能受体激动剂激活时，棕色脂肪组织中的Ucp1将质子回流和ATP合成解偶联，使质子梯度的势能以热能的形式释放，从而促进机体产热。近年来，研究人员发现棕色脂肪中还存在多种Ucp1非依赖性产热途径，这些途径也能够参与调节全身能量稳态，例如研究发现肌浆/内质网钙ATP酶(Sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum Ca²⁺ ATPase，SERCA)摄取Ca²⁺进入内质网，同时兰尼碱受体2(Ryanodine receptor 2, RYR2)介导Ca²⁺从内质网外流，这一过程与SERCA水解ATP相偶联，进而产生热量。也有研究发现在肌酸循环的过程中也会释放热能，肌酸循环即在酶的催化作用下，细胞内发生连续的肌酸磷酸化和去磷酸化，从而消散高能磷酸键的能量，并释放大量热量的循环反应。在反应进程中肌酸激酶将ATP上的高能磷酸键转移至肌酸生成磷酸肌酸和ADP，然后磷酸酶将磷酸肌酸水解生成磷酸和肌酸，同时将释放的能量转换为热能。但目前对于非依赖性Ucp1产热途径的研究主要集中在种系Ucp1敲除小鼠(Ucp1^-/-小鼠)中，虽然种系Ucp1^-/-小鼠模型推进了有关脂肪细胞产热的研究，但种系Ucp1^-/-小鼠的BAT中存在Ucp1缺失外的其他变化，例如氧化磷酸化复合物表达水平降低和线粒体完整性的破坏，这些变化可能会减弱任何产热途径的产热能力。此外，由于种系Ucp1^-/-小鼠在BAT和全身表现出严重的免疫紊乱，无法正常产热，因此有研究人员认为此时用以维持小鼠产热的Ucp1非依赖性产热机制可能在BAT之外被大幅上调。

目前虽然已经在脂肪细胞内部发现存在着钙循环、肌酸循环等多种Ucp1非依赖性产热途径，然而这些途径是否能够在脂肪细胞内部与Ucp1相互调控尚不清楚，为了解答这一问题，麦吉尔大学Lawrence Kazak团队进行相关研究，其成果“Parallel control of cold-triggered adipocyte thermogenesis by UCP1 and CKB”近期发表在Cell Metabolism，该研究发现在棕色脂肪细胞中存在UCP1和CKB两种途径平行调控产热，即棕色脂肪细胞产热并不完全依赖于UCP1。

敲黑板啦！

1、F1杂交种系Ucp1-/-小鼠会发生继发性变化

2、脂肪细胞产热并不完全依赖于UCP1

3、UCP1和CKB能够介导寒冷刺激下的平行产热

4、寒冷刺激下棕色脂肪中会再生UCP1和CKB

研究结果

1. F1杂交种系Ucp1^-/-小鼠发生继发性变化

近交系(129S1/SvImJ或C57BL/6J)Ucp1^-/-小鼠表现出明显的寒冷不耐受，而杂交系(129S1/SvImJ x C57BL/6J)Ucp1^-/-小鼠具有耐寒性。中度寒冷刺激条件下(8-10周龄，15℃冷暴露14天)，与各自同窝Ucp1^-/+小鼠相比，近交系Ucp1^-/-小鼠(雌鼠和雄鼠)和杂交系Ucp1^-/-小鼠(雌鼠和雄鼠)的BAT中呼吸链蛋白NADH:泛醌氧化还原酶B8亚基(NADH:Ubiquinone Oxidoreductase Subunit B8, NDUFB8)、琥珀酸脱氢酶B亚基(Succinate Dehydrogenase Complex Subunit B, SDHB)和线粒体细胞色素c氧化酶Ⅰ(Mitochondrial Cytochrome C Oxidase Ⅰ, MTCOI)表达水平均显著降低(图1A-D)(小编注：NDUFB8、SDHB和MTCOI分别是线粒体复合物I、II和IV的亚基)。并且与在热中性环境(30℃，3周)相比，近交系Ucp1^-/-小鼠和杂交系Ucp1^-/-小鼠在中度寒冷环境下(15°C，2周)呼吸链蛋白的下降幅度均更加明显 (图S1A-D)。定量蛋白组学能更广泛的检测所有电子传递链蛋白，研究人员使用定量蛋白组学研究发现在30℃环境下，近交系Ucp1^-/-小鼠和杂交系Ucp1^-/-小鼠BAT中电子传递链蛋白均减少。这些研究表明，杂交系Ucp1^-/-小鼠的耐寒性与BAT中电子传递链无关。此外，研究人员发现在中度寒冷刺激下，近交系Ucp1^-/-小鼠和杂交系Ucp1^-/-小鼠的肌酸激酶b(Creatine Kinase B, CKB)和组织非特异性碱性磷酸酶(Tissue Non-Specific Alkaline Phosphatase, TNAP)蛋白水平均高于对照(Ucp1^-/+)小鼠(图1E-H)。而在热中性条件下，近交系Ucp1^-/-小鼠和杂交系Ucp1^-/-小鼠的CKB和TNAP没有代偿性升高(图S1E-H)。这些数据表明，在多个品系的小鼠中敲除Ucp1会诱导肌酸无效循环的效应物水平上调，然而杂交系Ucp1^-/-小鼠的BAT会表现出电子传递链蛋白减少等继发性变化，这些变化对产热具有影响，继续使用该模型研究BAT内Ucp1依赖性和非依赖性产热途径存在弊端。因此，研究人员采用了其他策略进行进一步研究。

图1.诱导性UCP1敲除

图S1.呼吸链蛋白CKB和TNAP的相对表达水平

2. 诱导细胞特异性敲除Ucp1

为了避免种系Ucp1^-/-小鼠BAT中的继发性变化混淆代谢特征，研究人员利用Cre-ERT2系统，构建了在Ucp1阳性脂肪细胞中Ucp1诱导性失活的小鼠(简称Ucp1^iBKO小鼠)(图1I)。Ucp1^-/-小鼠和Ucp1^iBKO小鼠及各自同窝对照小鼠(分别为Ucp1^+/+小鼠和Ucp1^fl/fl小鼠)在室温下(RT;23℃±1℃)饲养，并连续三天腹腔注射他莫昔芬。7天后，将小鼠转移到30℃环境下饲养7-9天（小编注：此处作者注射他莫昔芬后在30℃热中性条件下饲养小鼠，该条件下UCP1本身表达较低，可进一步突出低温环境对各组小鼠UCP1的影响。此外，作者在原文中认为该条件可诱导Ucp1^-/-小鼠出现失温现象，因此选择该条件），然后开始检测小鼠表型变化(图1J)。在后文的研究中，作者确定这些处理能够引发种系Ucp1^-/-小鼠对冷诱导低温的完全敏感性，因此研究人员认为该条件对于测试该诱导型模型比较适用。研究人员发现在表型监测前的时间点，与Ucp1^fl/fl对照小鼠相比，雌性和雄性Ucp1^iBKO小鼠BAT中Ucp1的表达水平显著降低(图1K)。与Ucp1^fl/fl对照小鼠相比，Ucp1^iBKO小鼠SAT中Ucp1 的表达水平也有所降低，而SAT中起始Ucp1 表达水平低于BAT中相应丰度的1%，在性腺周围脂肪组织中Ucp1则几乎不表达(图1K)。除此之外，研究人员还发现与Ucp1^fl/fl对照小鼠相比，雌性和雄性Ucp1^iBKO小鼠BAT中Ucp1蛋白水平显著降低，其Ucp1的降低程度与种系Ucp1^-/-小鼠相似(图1L)。在寒冷刺激下，Ucp1^fl/fl小鼠BAT中Ucp1基因和蛋白表达水平显著提高，而Ucp1^iBKO小鼠BAT中Ucp1并未发生相似变化(图1M、N)。接下来，研究人员纯化出线粒体并测量被鸟苷二磷酸(Guanosine diphosphate, GDP)阻断的耗氧量（小编注：GDP能够抑制UCP1介导的质子传递过程），与对照小鼠相比，GDP显著抑制种系Ucp1^-/-小鼠的线粒体呼吸，Ucp1^iBKO小鼠也存在相同的现象(图1O)。接下来，研究人员通过给适应室温的小鼠BAT上方皮下注射去甲肾上腺素来探究药理激活后能量消耗的变化情况，发现与对照小鼠相比，雌性和雄性Ucp1^-/-小鼠和Ucp1^iBKO小鼠在NA刺激后能量消耗增强被抑制(图1P、Q)。总的来说，这些数据说明研究人员成功构建出诱导细胞特异性敲除UCP1的小鼠模型（小编注：本文中使用大量实验验证他莫昔芬诱导敲除UCP1的原因是作者为了突出该模型与常规敲除UCP1的不同之处，即诱导敲除UCP1不会造成继发性影响，如线粒体损伤，电子传递链蛋白减少等）。

3.诱导Ucp1缺失后，BAT中未发生继发性变化

电子显微镜结果表明，与对照组(Ucp1^+/+小鼠)相比，Ucp1^-/-小鼠(小鼠处理同Figure1J)BAT中线粒体嵴形态存在异常，而Ucp1^fl/fl小鼠和Ucp1^iBKO小鼠BAT中线粒体嵴形态无显著变化(图2A)。研究人员使用定量蛋白质组学研究发现，与同窝对照小鼠相比，雌性和雄性Ucp1^-/-小鼠BAT中的蛋白质组均发生显著改变(图2B)，接着研究人员对Ucp1^-/-小鼠BAT中持续下调且独立于性别的蛋白质进行分析，发现电子传递链、NADH脱氢酶复合物组装、氧化磷酸化和线粒体呼吸链复合物组装相关通路显著富集(图2C)，且大多数蛋白质组的改变由复合体I、III和IV的核和线粒体DNA蛋白的减少引起的。BAT中上调的蛋白表现出一定的性别依赖性，与Ucp1^+/+对照小鼠相比，雄性Ucp1^-/-小鼠BA中与炎症相关的蛋白表达水平上调，而雌性Ucp1^-/-小鼠BAT中与线粒体结构和重构相关蛋白表达上调(图2C)。总的来说，这些数据表明，与适应标准室温(23℃±1℃)的Ucp1^+/+小鼠相比，种系Ucp1^-/-小鼠中BAT的蛋白质组学组成严重受损，说明在不进行寒冷刺激的情况下BAT也会发生继发性变化。与此不同的是，Ucp1^iBKO和Ucp1^fl/fl小鼠BAT的蛋白质组非常相似，在诱导Ucp1敲除后的雌雄鼠中仅有两个蛋白发生显著改变，即UCP1本身和细胞分裂因子7(Dedicator Of Cytokinesis Protein 7, DOCK7)(图2D、E)。

线粒体呼吸上游级联信号的中断也会影响机体UCP1的产热功能。研究人员发现与Ucp1^+/+对照小鼠相比，雌雄种系Ucp1^-/-小鼠BAT中三种β-肾上腺素能受体(βARs)Adrb1、Adrb2、Adrb3的表达水平均有所降低，而诱导Ucp1敲除小鼠BAT中β-肾上腺素能受体的表达水平未发生变化(图2F-H)。此外，研究人员从雌雄种系Ucp1^-/-小鼠中分离棕色脂肪细胞，发现与对照组相比，NA刺激脂解的效果降低了约10倍，然而Ucp1^iBKO和Ucp1^fl/fl小鼠棕色脂肪细胞的脂解率相同(图2I)。这些数据与先前普遍认为的Ucp1^-/-小鼠棕色脂肪细胞具有完整的脂解信号相矛盾，但与研究人员观察到的β-肾上腺素能受体表达减少以及先前研究显示的种系Ucp1^-/-小鼠BAT中NA诱导的脂解效果降低相一致。总的来说，这些数据表明诱导Ucp1缺失有助于对Ucp1依赖性产热的研究，并且能够避免对种系Ucp1^-/-小鼠BAT中产生破坏。

图2.诱导性UCP1敲除，无继发性变化

4. 脂肪细胞产热并不完全依赖于UCP1

为了探究UCP1对脂肪细胞产热的贡献，研究人员首先测量了棕色脂肪细胞固有的产热反应，研究人员从Ucp1^-/-小鼠中分离出棕色脂肪细胞，而后在30℃环境培养7天，结果发现与Ucp1^+/+棕色脂肪细胞相比Ucp1^-/-棕色脂肪细胞由肾上腺素驱动的产热功能显著受损(图3A)。相比之下，Ucp1^iBKO棕色脂肪细胞表现出与Ucp1^fl/fl和Ucp1^+/+棕色脂肪细胞相同的产热能力(图3A)，同时各组间的基础呼吸没有差异(图S2A)。在Ucp1^-/-棕色脂肪细胞中缺乏NA驱动的产热反应，而在Ucp1^iBKO棕色脂肪细胞中存在该反应，这表明在Ucp1^-/-棕色脂肪细胞中UCP1非依赖性产热反应受损。与此同时，研究人员发现与Ucp1^+/+对照小鼠相比，种系Ucp1^-/-小鼠BAT中的α-肾上腺素能受体(alpha-adrenergic receptor, Adra1a)表达水平显著降低，但在Ucp1^iBKO小鼠的BAT中未发生类似变化(图3B)。已有文献表明ADRA1A信号通路能够促进NA驱动的UCP1非依赖性产热，ADRA1A(使用1μM的ADRA1A激动剂A61603)的激动作用能够增强cAMP(forskolin：cAMP激动剂)介导的呼吸反应，这种反应在Ucp1^+/+，Ucp1^fl/fl和Ucp1^iBKO棕色脂肪细胞中相似，但不存在于Ucp1^-/-棕色脂肪细胞中(图3C)。这些数据与上述脂解研究相结合，能够说明从出生起就缺乏UCP1的产热脂肪细胞参与代谢燃料输送相关上游信号的能力降低，从而进一步减弱了产热输出。更重要的是，ADRA1A传导的产热过程80%-90%由CKB和TNAP介导，因此在Ucp1^-/-产热脂肪急性分离的棕色脂肪细胞中，CKB和TNAP介导的UCP1非依赖性产热过程受到损害。

由于BAT介导的能量消耗对于机体在寒冷环境下维持体温至关重要，接下来研究人员检测了急性寒冷刺激后小鼠直肠温度的变化。研究人员将小鼠从30℃转移到5℃环境2.5小时，种系Ucp1^-/-小鼠体温显著降低(对照组Ucp1^+/+小鼠)，而Ucp1^iBKO小鼠(对照组Ucp1^fl/fl)的体温仅略微降低并相对恒定(图3D)，因此出生时缺乏Ucp1的小鼠相对于其同窝对照小鼠表现出寒冷不耐受，这种表型比成年后诱导Ucp1缺失的小鼠更为严重。研究人员还发现种系Ucp1^-/-小鼠虽然体温下降，但其与同窝对照的能量消耗相似，因此种系Ucp1^-/-小鼠在寒冷环境中的较低体温并不是全身代谢产热受损的结果，(图S2B)且种系Ucp1^-/-小鼠（寒冷不耐受）、Ucp1^+/+小鼠、Ucp1^iBKO（耐寒）、Ucp1^fl/fl在寒冷刺激下的能量消耗最终能够达到相似的水平。在先前的研究中，研究人员通过间接热量法测量发现在5℃时若小鼠（小编注：作者发现本实验中所有基因型的C57小鼠都符合这个规律，所以作者在后续检测中以0.2kcal/h为分界线进行分组）的能量消耗降至0.2kcal/h，此时直肠温度为28℃或更低，这与小鼠仍然能够在寒冷中存活相矛盾，因此，研究人员以高或低于0.2kcal/h的能量消耗水平进行初步分组，用以区分寒冷不耐受小鼠与耐寒小鼠。为了避免手术体温计植入或使用直肠探针干扰产热输出，研究人员选择非侵入性方法（小编注：作者使用代谢笼进行EE检测来作为体温下降的指标。作者在先前发现EE低于0.2kcal/h时小鼠出现失温症状(低于28℃)，通过这种方式可防止肛温侵入式检测对小鼠的影响）测量小鼠体温，发现所有Ucp1^-/-小鼠在寒冷环境下都表现出体温降低的寒冷不耐受状况(图3E、F)，而大多数Ucp1^iBKO小鼠具有耐寒性(图3E、F)。耐寒的Ucp1^iBKO小鼠与Ucp1^+/+和Ucp1^fl/fl小鼠相比，能量消耗没有差异(图S2C、D)，表明不同基因型间的“产热耗能比”相似。为了进一步探究热量守恒，研究人员绘制了从热中性到亚热中性的一系列环境温度变化与能量消耗的关系图(Scholander图)，Scholander曲线的斜率反映了热量守恒的程度。不同基因型的同性别鼠体重相似(图S2E、F)，且虽然随着环境温度的降低，小鼠能量消耗增加，但不同基因型的Scholander曲线(能量消耗)始终没有出现显著差异(图3G、H)，这些数据排除了热量守恒能够维持Ucp1^iBKO小鼠体温的观点。研究人员也发现Ucp1^iBKO小鼠残留的UCP1与小鼠在寒冷中维持体温的能力不存在相关性(图S2G、H)，这说明BAT中残留的UCP1不能充分解释Ucp1^iBKO小鼠的耐寒表型。总体而言，这些结果表明UCP1对于脂肪细胞内在产热和维持寒冷环境下的体温并非不可或缺的，随后研究人员探究了其生理学相关性。

图3.种系和诱导性Ucp1敲除间不同的产热输出

图S2.种系与诱导性UCP1敲除的产热和体温

5.UCP1和CKB介导的平行产热途径

遗传相互作用是指当两个基因同时突变时的表型与两个基因分别突变后叠加的表型不同的现象。对遗传相互作用的系统分析将单突变和双突变表型进行定量比较，从而确定两个基因是否存在相互作用以及存在何种相互作用。当两个基因同时突变后产生的表型比两个基因单独突变后产生的表型更严重时，这种突变组合被定义为负向遗传相互作用，对突变组合进行研究是描述基因之间功能关系的有力手段。已有报道表明脂肪细胞内与不依赖于Ucp1的底物循环过程与Ucp1的基因缺失有关。值得注意的是，在并未敲除UCP1的小鼠中，肌酸无效循环通过肌酸磷酸化和磷酸肌酸去磷酸化进行底物循环，同时释放大量的ADP加速ATP周转，从而促进产热。目前研究发现，在敲除维持脂肪细胞肌酸丰富度、肌酸磷酸化、或磷酸肌酸去磷酸化过程相关基因后，小鼠产热输出受损。该现象可以解释为与肌酸通过无效肌酸循环促进能量消耗不同，经典的磷酸肌酸穿梭通过在UCP1介导的解偶联过程中传递ATP水解的自由能来维持细胞健康。这一观点预示着并不是UCP1缺失后，肌酸无效循环才能够发挥作用，即使UCP1存在时，肌酸代谢的效应物也能够发挥作用甚至更为关键。

在实质棕色脂肪细胞中表达的CKB是主要的肌酸激酶同工酶，在先前报道的遗传功能丧失实验中已经证实其负责主体BAT中大部分的肌酸激酶活性。于是研究人员假设，如果CKB在脂肪细胞内能够与UCP1平行调控产热，那么与单一敲除相比，诱导脂肪特异性共敲除CKB和UCP1应该协同减弱全身产热。为了评估UCP1和CKB对产热的贡献，研究人员使用Adipoq-CreERT工具，通过诱导方式构建了所有脂肪细胞缺乏Ucp1(Ucp1^iAKO)、Ckb(Ckb^iAKO)或同时缺乏两种基因(iADKO)的小鼠(图4A)。研究发现他莫昔芬给药能够导致雌雄小鼠BAT中UCP1和CKB的严重缺失(图4B、C)，证明成功构建了诱导性脂肪细胞特异性单敲除和双敲除小鼠。与任意单敲除小鼠相比，雌雄iADKO小鼠对寒冷更加敏感(图4D、E、图S3A)，因此，Ucp1和Ckb表现出负遗传相互作用，这有力地证实了它们平行调控脂肪细胞产热以应对急性冷暴露环境。

图4.通过UCP1和CKB平行调控寒冷环境诱导的产热

图S3.Ucp1和/或Ckb敲除的耐寒性、低温和体重

6.iADKO小鼠的脂肪组织外恒温机制未发生变化

为了探究Ucp1和Ckb的诱导缺失是否会影响“产热耗能比”，研究人员绘制了Scholander曲线，发现不同基因型雌雄小鼠都具有相似的重量(图S3B、C)，并且所有小鼠的能量消耗都会因环境温度降低而增加(图4F、G)，而所有基因型的小鼠Scholander曲线的斜率相似(图4F、G)，表明对低温环境造成的环境散热的增加并不能解释iADKO小鼠的寒冷不耐受表型。

骨骼肌中的钙循环产热由肌浆网钙Ca²⁺ATP酶(sarcoplasmic/ endoplasmic reticulum Ca²⁺ ATPase，SERCA)介导Ca²⁺进入肌肉内质网腔内和兰尼碱受体 1(Ryanodine receptor 1, RYR1)介导的Ca²⁺泄漏两个部分相协调完成。然而，研究人员发现在所有基因型小鼠的红腓肠肌(图4H-M)或比目鱼肌(图S3D-G)中，钙摄取、SERCA活性和SERCA偶联效率均未发生变化。这表明骨骼肌非战栗性产热功能受损与iADKO小鼠的寒冷不耐受表型无关。此外，研究人员未在脂肪细胞缺乏Ucp1(Ucp1^iAKO)、Ckb(Ckb^iAKO)或同时缺乏两种基因(iADKO)的小鼠中发现骨骼肌非战栗性产热代偿性升高的证据。

7.寒冷刺激的BAT中UCP1和CKB再生

基于iADKO小鼠在5℃环境下寒冷不耐受，研究人员接下来探究了其在30℃和中度寒冷环境下(15℃)BAT的适应性，结果发现在30℃环境下，与对照组相比，Ckb^iAKO和Ucp1^iAKO小鼠BAT的Ckb和Ucp1表达水平分别降低(>90%)，并且两者BAT的mRNA降低程度均与iADKO小鼠相似(图5A、B)。同时研究人员发现当一个等位基因失活时，即在Ucp1^iAKO;Ckb^fl/+和Ckb^iAKO;Ucp1^fl/+小鼠的BAT中Ckb和Ucp1的表达水平与对照相比降低约50%(图5A、B)。在30℃环境下的Ckb^iAKO和Ucp1^iAKO小鼠BAT中的CKB和UCP1蛋白水平分别降低，而iADKO小鼠BAT中两种蛋白几乎完全消失(图5C、D)，同时研究人员发现交感神经支配的标志物酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase, TH)在所有样本中的丰度相似(图5C、D)。

UCP1非依赖性产热介质被认为在Ucp1缺失时被补偿性诱导，以诱发UCP1阴性脂肪细胞产热，然而这些影响仅在不能重建UCP1蛋白的种系Ucp1^-/-小鼠中进行了研究。事实上，与Ucp1^+/+小鼠相比，雌性和雄性种系Ucp1^-/-小鼠BAT中的Ckb mRNA表达水平升高，并且这种变化与环境温度无关(图5A、E)。此外，2周的15℃中度寒冷环境使得iADKO小鼠BAT中Ucp1和Ckb mRNA和蛋白水平重现(图5E-H)。除此之外，研究人员发现诱导Ucp1缺失能诱发寒冷刺激下UCP1和CKB的再生，而诱导Ckb缺失则不能发生该现象(图5G、H)。如果CKB仅在UCP1缺失的情况下升高(例如在种系Ucp1^-/-小鼠中其他产热介质代偿性增加)，那么iADKO和Ucp1^iAKOBAT中UCP1的恢复应限制CKB的上调，然而在UCP1本身被重新激活后，iADKO和Ucp1^iAKO小鼠的BAT仍会诱导CKB蛋白产生，因此UCP1和CKB的协调替换为两者平行促进产热的观点提供了支持性的实验证据。

与此同时，研究人员发现在15℃环境下，Ucp1的缺失导致TH蛋白水平升高(图5G、H)，上述发现与SNS介导的信号是刺激棕色脂肪生成所必需的结论相一致。为了区分主体BAT中CKB表达是在实质性棕色脂肪细胞内自行恢复，还是由其在支配交感神经内的表达引起，研究人员给iADKO小鼠和同窝的Ucp1^flfl;Ckb^fl/fl对照小鼠注射了他莫昔芬，并在15℃下饲养2周以诱发iADKO小鼠中CKB和UCP1的再生，随后将iADKO小鼠分成两组，其中一组接受玉米油载体注射，而另一组接受第二轮他莫昔芬注射(图5I)。结果发现UCP1和CKB的表达只在进行单轮他莫昔芬注射的iADKO小鼠中恢复到对照水平，而在进行二轮他莫昔芬注射的iADKO小鼠中这种恢复水平消失(图5J、K)。此外，与对照组小鼠相比，iADKO小鼠BAT中TH蛋白升高，即使在CKB重新缺失的小鼠中也是如此(图5J、K)，这表明CKB蛋白的重建是发生在实质棕色脂肪细胞内。与对照组小鼠相比，iADKO BAT中TNAP蛋白的平均表达水平上调(图5J、K)，而编码TNAP的组织非特异性碱性磷酸酶基因(Alkaline Phosphatase Biomineralization Associated, ALPL) mRNA水平未发生变化(图S4A、B)，这说明CKB和UCP1共缺失对TNAP的丰度进行转录后调控。

为了进一步了解BAT内CKB和UCP1蛋白水平何时得到恢复，研究人员在中等寒冷环境中的不同时间点检测了CKB和UCP1蛋白表达水平(图6A)。结果发现与对照Ucp1^flfl;Ckb^fl/fl小鼠相比，在30℃下iADKO小鼠BAT中的CKB和UCP1蛋白水平降低，并在15℃下饲养4天后仍显著降低。然而在15℃饲养8天后，CKB和UCP1在雌雄小鼠中重现(图6B、C)，但在30℃饲养相同时间小鼠BAT中两种蛋白并未重新出现(图S5A)。除此之外，研究人员发现在30℃下iADKO小鼠的BAT重量高于对照小鼠，而在15℃饲养4天后显著增加，在15℃饲养8天后恢复到对照水平（小编注：此处图中说明在15℃饲养4天后，与对照Ucp1^flfl;Ckb^fl/fl小鼠相比，iADKO小鼠的BAT重量显著增加，作者认为在此期间iADKO小鼠BAT中脂质含量升高，从而导致BAT变重，在15℃饲养8天后iADKO小鼠BAT中的脂质含量大幅降低，因此iADKO小鼠BAT的重量也降低至对照水平）(图6D)，基于此，研究人员在这些时间点对BAT进行组织学分析，发现在30℃时不同基因型间的脂质含量没有明显差异(图6E)。在15℃下饲养4天后Ucp1^flfl;Ckb^fl/fl小鼠BAT中脂质含量减少，而iADKO小鼠BAT中脂质含量仍然升高，然而在15℃饲养8天后，iADKO小鼠BAT中的脂质含量大幅降低至对照水平(图6F)。通过WB实验，研究人员发现这是组织中CKB完全恢复和UCP1部分恢复的时间点(图6B、C)。这些发现表明，再生的CKB和UCP1的协同产热活动抑制了iADKO棕色脂肪细胞中的脂质积累，处在寒冷环境下的iADKO小鼠BAT中CKB和UCP1恢复的动力学表明，CKB蛋白的表达早于UCP1，并在棕色脂肪形成的早期阶段发挥更大的产热作用。然而这些推测仍需进一步验证。

接下来，研究人员检测了BAT中与UCP1非依赖性脂肪细胞产热途径相关基因的mRNA表达水平，并重点研究了编码内质网钙摄取和释放介质(图S6A-D)和脂溶性衍生脂肪酸酯化(图S6E-R)的转录本，结果发现不同基因型小鼠在30℃时这些基因的表达水平没有差异，但在15℃时具有一定关联。Ryr2在Ucp1^iAKO和iADKO小鼠的BAT中被诱导，但在种系Ucp1^-/-小鼠中未被诱导(图S6D)。无效钙循环在种系Ucp1^-/-小鼠中表现出米色细胞特异性，因此研究人员的数据表明诱导Ucp1缺失可能是适合重新研究BAT中无效钙循环潜在作用的模型。与Ucp1^+/+对照小鼠相比，种系Ucp1^-/-小鼠BAT中甘油激酶(Glycerokinase, Gk)和二酰基甘油-酰基转移酶1(Diacylglycerol O-Acyltransferase 1, Dgat1)表达水平选择性升高(图S6J-L)。然而mRNA或蛋白表达不能完全证实或排除代谢途径通量，因此这些推测的UCP1非依赖性效应物的生理相关性有待于通过脂肪细胞选择性功能丧失实验进行验证。

图5.通过寒冷刺激的棕色脂肪从头生成协调恢复UCP1和CKB

图6.UCP1和CKB寒冷恢复的时间过程

图S4.Alpl mRNA水平

图S5.处于热中性的UCP1和CKB

图S6.肌肉和BAT中UCP1非依赖性产热基因的表达

总结

在本研究中，研究人员发现种系Ucp1^-/-小鼠在棕色脂肪组织中存在继发性变化，于是通过构建诱导型脂肪细胞选择性Ucp1敲除小鼠(Ucp1^iBKO)来避免继发性变化，结果发现种系Ucp1^-/-小鼠不能够抵抗寒冷，但大多数Ucp1^iBKO小鼠在寒冷中能够保持恒温。接着研究人员发现诱导脂肪细胞特异性共敲除UCP1和CKB会加剧小鼠对寒冷的不耐受，而在成熟脂肪细胞中UCP1缺失或UCP1/CKB共缺失后，适度的冷暴露会触发成熟棕色脂肪细胞的再生，从而协调恢复UCP1和CKB表达。综上所述，研究人员认为脂肪细胞产热并不完全依赖于UCP1，而是由UCP1和CKB平行调控脂肪细胞产热，并且二者表现出负遗传相互作用，对于治疗肥胖及相关代谢疾病具有重要意义。

原文链接：https://www.cell.com/cell-metabolism/fulltext/S1550-4131(24)00001-9