代谢学人

Cell Metabolism：铁死亡终结者防治脂肪肝

撰文 | 王蕊  夏志蕊  王颖雯  朱丽君  刘爽  曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

哺乳动物已经进化出复杂的营养反应途径，将外部可用的能量与内部代谢稳态联系起来，而这些途径涉及细胞能量代谢物的变化，这些代谢物既作为代谢燃料又可以作为下游效应物在生命活动中发挥作用。其中一个非常关键的例子就是酮体代谢物β-羟基丁酸(BHB)，BHB水平在碳水化合物可用性低的条件下上升(如饥饿、间歇性禁食或生酮饮食期间)。BHB作为一种代谢燃料，可以被代谢组织(如大脑和心脏等)氧化产生ATP。此外，BHB还是一种激活G蛋白偶联受体的信号分子，可以通过翻译后修饰或抑制核组蛋白去乙酰化酶活性改变细胞和代谢过程（小编注：BHB可以使一些饥饿相关基因组蛋白上的赖氨酸发生BHB酰化修饰，帮助机体快速调整并适应能量供应缺乏引起的代谢变化，其次，BHB直接抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC）的活性，从而改变蛋白质的乙酰化水平，影响基因表达，但是更加详细的机制还有待研究）。 

目前，介导肝脏BHB产生和肝脏外BHB氧化的经典初级代谢途径已被详细报道。在肝脏生酮过程中，脂肪酸氧化导致乙酰辅酶A(CoA)的产生，随后乙酰CoA依次通过3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶2(HMGCS2)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶(HMGCL)和3-羟基丁酸脱氢酶1(BDH1)的作用产生BHB。BHB一旦产生则被输出到血循环中，然后就可以被肝外组织吸收，并通过BDH1、琥珀酰辅酶A:3-酮酸辅酶A转移酶(SCOT)和三羧酸循环(TCA)进行氧化。重要的是，所有已知的BHB代谢途径都直接涉及一种相同的代谢互换途径——即从BHB到直接用于产生ATP的初级中间体（小编注：即乙酰辅酶A）。然而，BHB在初级代谢之外的代谢途径至今尚未报道(小编注：初级代谢是指生物体通过吸收营养物质，将其转换为细胞结构的组成部分，维持正常的生命活动，初级代谢产物是生物体基本生存所必需的，如能量代谢过程中产生的ATP。次级代谢是指生物体在特定条件下，以初级代谢产物为前体，合成对生命活动无明显直接功能的物质的过程。这些代谢产物通常分子结构复杂，如抗生素、激素、生物碱、毒素等。初级代谢可以为次级代谢产物合成提供前体物质和所需要的能量,而次级代谢则是初级代谢在特定条件下的继续和发展)。先前有研究表明，肌肽二肽酶2(CNDP2)在体外催化乳酸和氨基酸的缩合(小编注：CNDP2，是一种非特异性二肽酶，属于M20家族，在人体组织中分布广泛，尤其是在肾脏、肝脏、脾脏和大脑皮层中的表达量较高。CNDP2在人体中的作用主要包括：(1)通过形成Lac-Phe从而清除乳酸；(2)促进谷胱甘肽形成，调节氧化应激；(3)不同的CNDP2变体可能调节循环代谢物的浓度；(4)分解肌肽)。本文研究人员之前的文章中也报道了在体内，该生化途径是一种生理相关的合成反应。N-乳酸化氨基酸中最丰富的成员——N-乳酰苯丙氨酸(Lac-Phe)是一种由运动和二甲双胍诱导的代谢物，可抑制食物的摄入，并减轻体重。这些数据表明，乳酸的代谢途径超出了糖酵解和初级代谢的范畴，应当还包括产生乳酸衍生信号代谢产物的次级代谢途径。从化学角度来看，BHB和乳酸表现出高度的结构相似性：两者都是羟基脂肪酸，只有一个亚甲基不同。因此，研究人员推测BHB可能和乳酸一样，也可以被酶偶联到氨基酸上，这一预测的代谢途径表明BHB次级代谢可能存在一个未知的途径，并且会产生一类独立代谢物——N-β-羟基丁酰化氨基酸(BHB-氨基酸)。然而，在已发表的文献中，并未存在任何证据可以证明游离氨基酸的BHB酰化，也无法在METLIN(代谢物鉴定及代谢物信息查询的数据库)、HMDB(人类代谢数据库)、GNPS(串联质谱数据的数据库)等公共数据库中找到任何BHB氨基酸作为内源性代谢物的注释。

参考文献：

[1] Ocariza,M.G.C.,et al. (2024). Journal of cardiovascular translational research, 10.1007/s12265-024-10560-4.

近期，一篇发表在Cell上名为“A β-hydroxybutyrate shunt pathway generates anti-obesity ketone metabolites”的文章证明了CNDP2在体外和体内催化游离氨基酸的BHB酰化。内源性BHB氨基酸存在于小鼠和人类血浆中，可诱导酮症且与遗传调控相关。N-β-羟基丁基苯丙氨酸(BHB-Phe)是最丰富的BHB氨基酸，在结构和功能上与Lac-Phe同源。本文首次揭示了β-羟基丁酸通过一种全新的次级代谢通路生成BHB-氨基酸，通过激活下丘脑和脑干中的特定神经元，抑制进食、抵抗肥胖。因此，LRP1如何维持脑内稳态，以及其在缺血性脑卒中里发挥的作用仍有待深入研究。

拓展阅读

酮体BHB的产生及转换

      酮体是肝脏脂肪酸氧化分解的中间产物乙酰乙酸、β-羟基丁酸(BHB)及丙酮三者统称。在缺乏足够碳水化合物供能时，人体可以通过脂肪分解产生酮体，经过酮体代谢，将酮体转化为能量，为自身生理活动供能。因此，酮体代谢通常发生在长时间不进食、低碳水化合物饮食、饥饿、高强度运动或糖尿病等情况下。酮体代谢的主要过程包括酮体产生、酮体转运和酮体利用三个阶段。酮体产生主要发生在肝脏中。当机体血糖水平下降时，胰岛素分泌减少，胰高血糖素分泌增加。胰高血糖素激活脂肪细胞内的脂肪酸分解酶，使三酰甘油(TAGs)水解为甘油和游离脂肪酸。游离脂肪酸通过肉碱棕榈酰转移酶1/2(CPT1/2)进入肝脏线粒体后，被肝细胞摄取并通过脂肪酸β氧化途径进一步分解。在缺乏足够的碳水化合物供能的情况下，肝细胞将脂肪酸的代谢产物完全氧化为二氧化碳和水的能力减弱，从而氧化产生大量的乙酰乙酰辅酶A(AcAc-CoA)和乙酰CoA（小编注：当碳水化合物不足时，身体会将脂肪作为主要的能量来源，在这种情况下脂肪酸氧化增加，乙酰CoA大量产生。正常情况下，乙酰CoA会进入TCA循环进一步氧化分解，但是TCA循环需要草酰乙酸作为接受乙酰CoA的底物，形成柠檬酸，但是在碳水化合物不足的情况下，草酰乙酸的合成减少（其主要来源于葡萄糖代谢），限制了乙酰CoA进入TCA循环，因此在肝脏中乙酰CoA转化为酮体，氧化为CO2和水的能力减弱）。在肝细胞线粒体中，乙酰乙酰辅酶A(AcAc-CoA)和乙酰CoA在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合酶2 (HMGCS2)的作用下缩合生成3-羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)。随后，HMG-CoA被3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A裂解酶(HMGCL)裂解为乙酰乙酸(AcAc)和CoA。AcAc通过线粒体膜内相关的3-羟基丁酸脱氢酶1(BDH1)还原为D-BHB。肝脏产生的酮体可以通过自由扩散或由单羧酸转运蛋白1/2(MCT1)转运出线粒体，并离开肝脏(如何穿过细胞膜暂无报道)，经血循环运输到全身各组织器官，被肝外组织摄取利用。酮体的利用主要发生在心脏、肾上腺皮质和骨骼肌等生命活动旺盛的肝外组织。在肝外组织细胞的线粒体中，BDH1可将D-BHB转换为AcAc，并通过琥珀酰辅酶A：酮脂酰辅酶A转移酶(SCOT)进一步还原为AcAc-CoA，AcAc-CoA在经过一系列的反应变为乙酰CoA，进入三羧酸循环并产生ATP，为机体供能（小编注：在肝外组织，酮体可以被利用分解为乙酰CoA，参与TCA循环，这是由于草酰乙酸水平虽然受到了限制，但是在这些组织中可以利用别的途径合成足够的草酰乙酸，主要包括：（1）糖异生途径：在碳水化合物不足时，糖异生途径中丙酮酸可以利用丙酮酸羧化酶合成草酰乙酸；（2）氨基酸转化：一些氨基酸可以利用转氨反应合成草酰乙酸，如天冬氨酸通过天冬氨酸转氨酶将氨基转化到α-酮戊二酸上，生成草酰乙酸。而在肝脏中，由于碳水化合物不足，肝脏的草酰乙酸合成被抑制，限制了乙酰CoA进入TCA循环，导致乙酰CoA转化为酮体。草酰乙酸是TCA的关键中间产物，其可以通过多种途径合成，包括丙酮酸羧化酶的催化下与二氧化碳结合生成。在肝脏糖异生过程中，草酰乙酸的主要作用是作为合成葡萄糖的前体物质，而不是作为TCA循环的底物。在饥饿状态下，肝脏优先将草酰乙酸用于糖异生，以维持血糖水平，为脑组织等重要器官供能）。

参考文献：

[1] Puchalska, P., et al. (2021). Annual review of nutrition, 41, 49-77.

[2]Nelson, A. B.,et al. (2023). Nature metabolism, 5(12), 2062-2074. 

敲黑板啦！

1.CNDP2可在体外和体内催化氨基酸BHB酰化；

2.BHB-氨基酸是内源性的代谢物；

3.BHB-Phe可以减少食物摄入、减轻体重，并激活下丘脑和脑干神经群；

4. CNDP2介导的氨基酸BHB酰化活性和BHB-氨基酸代谢物在人体中保守；

​研究结果

1 .CNDP2在体外催化氨基酸的BHB酰化

为了确定CNDP2是否可以在体外催化氨基酸的BHB-酰化，研究人员对HEK293T瞬转FLAG标记的鼠源CNDP2或GFP，经过蛋白质印迹实验证实了CNDP2蛋白过表达成功，随后将BHB和苯丙氨酸(各20 mM)与HEK293T细胞的细胞裂解物孵育(图1A，辅图1A)。在37℃孵育1小时后，研究人员使用液相色谱-质谱法(LC-MS)测量了BHB-Phe的合成活性，结果显示，过表达CNDP2的细胞裂解物BHB-Phe合成活性比GFP组细胞裂解物高了140多倍，表明CNDP2除了可以合成Lac-Phe外，还可以合成BHB-Phe(图1B)。接下来，研究人员通过几个对照实验进一步检验了CNDP2依赖性BHB-酰化反应的底物特异性。结果显示，对于不同的底物，CNDP2催化效率不同。CNDP2催化氨基酸BHB-酰化和N-乳酸化速率相似，但对于较短的(如乙酸，C2)或较长的(如辛酸，C8)有机酸而言，CNDP2催化效率则显著降低(图1C)。使用Phe作为底物时，CNDP2催化的BHB-酰化活性最高，催化亮氨酸等疏水氨基酸的效率较低(<20%)，并且对大部分被测试的氨基酸没有催化活性(图1D)。对于肽底物而言，CNDP2不能催化其游离N端的BHB-酰化(辅图1B)。而且CNDP2与2-羟基丁酸(2-HB)有轻微的缩合活性，CNDP2与BHB异构体3-羟基异丁酸(3-HIB)无反应，即3-HIB不能被CNDP2当作底物(辅图1C)。

为了定量比较CNDP2依赖性的BHB-酰化和N-乳酸化的动力学，研究人员制备了纯化的小鼠CNDP2-FLAG重组蛋白进行体外动力学分析。结果显示，动力学数据符合Michaelis-Menten动力学模型(小编注：Michaelis-Menten动力学是描述酶催化反应速速率的数学模型，用来反映底物浓度和反应速率之间的关系，对于大多数的酶而言其曲线一般接近矩形双曲线)，且与乳酸相比较，BHB对CNDP2的活性位点具有更高的亲和力(BHB的Km=8.8 mM；乳酸的Km=33.4 mM)(小编注：Km为米氏常数，是酶促反应达最大速度(Vm)一半时的底物(S)的浓度。Km值的大小反映了酶与底物的亲和力。Km值越小，酶与底物的亲和力越大，说明酶对底物的结合能力越强)。相比之下，在底物浓度饱和条件下，CNDP2依赖性的Lac-Phe的合成速度比BHB- Phe的合成速度快(乳酸的Vmax=62.7 nM/min/mg， BHB的Vmax=3.5 nM/min/mg，图1E、F)。

最后，研究人员将产物BHB-Phe与CNDP2活性位点进行了分子对接(图1G)。该模型预测了BHB-Phe与几种关键活性位点残基的相互作用，如E166、D195和H455，随后将这些残基的单点突变瞬转到HEK293T细胞中(辅图1D)。结果显示，以上活性位点残基的突变都会减少CNDP2依赖性BHB-Phe和Lac-Phe的产生(图1H、I)。因此，BHB-酰化和N-乳酸化活性均依赖于CNDP2。此外，这两种催化活性不会轻易地被活性位点口袋中的单点突变解离（小编注：这种单点突变的方法无法有效分离BHB-酰化和N-乳酰化这两种催化活性，说明它们共享相同的活性位点）。

2 .小鼠组织中BHB酰化依赖于CNDP2

为了确定内源性CNDP2是否在小鼠组织中催化氨基酸BHB-酰化，研究人员首先使用CNDP2的抗体通过蛋白质印迹实验检测了CNDP2在各组织中的表达谱，并且用CNDP2-KO小鼠的组织证实了该抗体的特异性(辅图2A)。结果显示，CNDP2蛋白在肾脏和肠道中高表达，而在其他组织中表达较低(图2A)。由于肾、肠、脑、肝和股四头肌组织的CNDP2蛋白表达范围很广，因此研究人员利用野生型(WT)小鼠的这些组织总裂解物进行了体外BHB-Phe的合成活性实验。结果显示，肾脏和肠道的BHB-Phe合成活性较高(10-30 pmol/min/mg)，而脑、肝脏和股四头肌的BHB-Phe合成活性低(1-5 pmol/min/mg)(图2B)。这种不同组织的BHB-Phe合成活性在很大程度上与CNDP2在这些组织中蛋白表达相似。此外，肾脏BHB-Phe的合成活性表现出温度依赖性和重组CNDP2蛋白的温度依赖性相似(辅图2B、C)（小编注：酶本质上是蛋白质,大多数蛋白质在60度以后的稳定性开始下降，对应酶的活性也会随之改变，比如在进行CETSA实验（热稳定性实验）中，一般最大温度选择在68度左右，具体也是根据每个蛋白的特性确定，60度是一个普遍的选择）。因此，CNDP2蛋白的组织表达模式和温度都与组织BHB-Phe合成活性相关。接下来，研究人员使用来自CNDP2-KO小鼠的组织来确定CNDP2对组织BHB-Phe合成活性的影响。结果显示，CNDP2-KO小鼠肾脏和肠道BHB-Phe合成活性基本消失(>降低95%)，而其他组织的BHB-Phe合成活性也大大降低(脑降低>85%，肝脏降低>75%，股四头肌降低>60%)(图2B)。其次，研究人员使用亮氨酸(leu)或缬氨酸(Val)作为体外BHB -酰化的底物，发现在WT和CNDP2-KO组织中观察到类似的BHB-Leu和BHB-Val合成模式；并且在WT小鼠的肾脏和肠道组织中BHB -氨基酸合成活性最高，而在CNDP2-KO小鼠的组织中则基本消失(图2C、D)。在另外的对照实验中，研究人员分析了组织Lac-Phe合成活性，发现其与BHB-氨基酸合成模式相似，且依赖于CNDP2(图2E)。相比之下，WT小鼠中不同组织的肌肽水解则表现出不同的模式，肝脏和股四头肌的水解活性最高，肾脏、肠道和大脑的活性最低；而在CNDP2-KO组织中肌肽酶活性却没有改变(图2F)。因此，CNDP2是小鼠组织中负责BHB-氨基酸合成活性的主要酶；此外，尽管CNDP2在先前研究中表明其在体外具有肌肽水解活性，但它并不是一种主要的组织肌肽酶(小编注：此处是想证明CNDP2在小鼠组织里发挥的主要作用不是分解肌肽，而是合成BHB酰化或N-乳酸化的氨基酸。CNDP2又叫肌肽二肽酶，开始认为它的作用是分解二肽(β-Ala-His二肽酶)，但是在本部分的研究中发现，CNDP2 KO肌肽水解酶的活性并没有发生改变，说明CNDP2发挥的不是作为肌肽水解的作用。肌肽（Carnosine）是一种由β-丙氨酸和L-组氨酸通过肽键连接而成的二肽分子。它主要存在于骨骼肌、心肌和脑组织中，尤其是在高代谢活动的组织中含量丰富。肌肽的主要生理功能有：1.抗氧化作用: 肌肽分子中含有咪唑基，具有螯合金属离子的能力，这些金属离子是脂类氧化的主要催化剂。通过螯合金属离子，肌肽消除了金属离子的催化作用，从而抑制脂质氧化；肌肽侧链上的组氨酸残基可以作为氢的受体，具有捕捉自由基的作用，可以抑制包括非金属离子引起的脂肪氧化作用；肌肽也可通过激活Nrf2转录因子增强抗氧化应激作用；2.抗糖化作用: 肌肽含有一个游离的活泼氨基，能够非常迅速地与还原糖反应，从而竞争性地抑制机体的糖化反应；3.酸碱缓冲: 肌肽分子中的组氨酸残基含有咪唑基团，这个基团可以接受或释放质子（H⁺），从而起到缓冲溶液pH值的作用；4.抗疲劳和提高运动表现:肌肽在高强度运动中有助于减缓肌肉疲劳，并提高运动耐力和爆发力，这也是许多运动员服用 β-丙氨酸补充剂（促进肌肽合成）的原因，主要也是因为上述抗氧化和抗糖化的作用改善了线粒体代谢，提供能量供应；以及调节PH的作用帮助中和乳酸，从而延缓疲劳的发生;5.神经保护作用:肌肽能够通过抗氧化和抗炎作用，保护神经细胞免受损伤，具体机制文献尚未明确报道。6.促进伤口愈合:肌肽可以调节细胞增殖和修复过程，促进组织再生和伤口愈合，具体机制文献尚未明确报道）。

3 .BHB氨基酸是小鼠内源性代谢物

由于以前并没有文章报道过CNDP2催化的BHB-酰化反应产物BHB-氨基酸，因此研究人员开发了一种靶向代谢组学方法，以确定BHB-氨基酸是否可以在小鼠血浆中检测到。首先，研究人员通过BHB和苯丙氨酸之间的经典酰胺偶联合成了的BHB-Phe标准品，并对该标准品进行了碎片化，发现其中一个主要子离子对应于Phe (m/z = 164)，第二个较小的子离子对应脱羧产物(m/z = 206)(图3A)(小编注：在蛋白质谱中，电离后有过剩内能的分子离子能够以多种方式裂解，生成碎片离子。裂解方式包括简单开裂、重排开裂、复杂开裂和双重排开裂，这些碎片提供了化合物内部结构的信息)。接下来，研究人员发明了一种基于高效液相色谱三重四极杆质谱法(QQQ-LC/MS)的靶向多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)方法来监测BHB-Phe的母体到苯丙氨酸的转变(小编注：液相色谱三重四极杆质谱法(QQQ-LC/MS)结合了液相色谱和三重四极杆质谱的技术原理。样品首先通过液相色谱进行分离，不同化合物根据其与色谱柱固定相和流动相的相互作用被逐步分离开来；随后分离出的化合物进入三重四极杆质谱，通过电喷雾电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)形成带电离子，这些离子在第一四极杆(Q1)中被筛选，进入碰撞池(Q2)进行碎裂，生成的子离子再进入第三四极杆(Q3)进行检测和定量分析。这种方法通过多反应监测(MRM)模式，实现了高灵敏度和高选择性的定量分析)。在与标准品使用相同的保留时间洗脱后，研究人员在小鼠血浆中发现了一个内源性峰(图3A)。为了排除检测到2-HB-Phe和3-HIB Phe异构体的可能性，研究人员合成了2-HB-Phe和3-HB-Phe的标准品，并开发了可以区分这三种分子的MRM方法。虽然2-HB-Phe和3-HB-Phe也产生了对应于苯丙氨酸的子离子，但是研究人员也发现了这些异构体的独特变化(2-HB-Phe: 260 > 102，在N-Cα处断裂；3-HIB-Phe: 250 > 220，CH3O丢失，辅图3A、B)。对于BHB-Phe而言，超过99 %的总信号检测到了250>164的变化，而2-HB-Phe检测到了260 > 102和250 > 164的变化(比例6:1)；3-HIB-Phe则检测到250 >220和250 >164的变化(比例1.6:1)；此外，还发现超过99%的内源峰信号为260 > 164的变化(辅图3C)(小编注：数字260/102/250/220等代表的质谱图的横坐标，即样品的出峰时间，一般将出峰时间与相应标准品进行比对，从而判断该位置峰对应的物质是什么)。因此，BHB-Phe是内源性的代谢物，而2-HB-Phe和3- HB -Phe不是。

接下来，研究人员合成了BHB-Leu、BHB-Val和BHB-Met的标准品，它们也表现出相同特征的氨基酸子离子；使用类似的MRM方法，研究人员还检测到过渡和保留时间与实际标准品相同的内源性峰(图3B-D)，表明这些BHB氨基酸也是内源性代谢物。

由于这些氨基酸的合成来源是BHB，因此在营养或生理性酮症条件下，随着BHB水平升高，循环中的BHB氨基酸水平也会随之增加。在生酮饮食1周、禁食24小时或口服酮酯(3g/kg of body weight )30分钟后，研究人员测量了小鼠血浆中BHB -氨基酸水平，结果表明这些情况下血浆BHB水平均升高(辅图3D)，并且这些刺激都使BHB-氨基酸升高了2到10倍(图3E-H)。在生酮饮食的诱导下，BHB-氨基酸水平产生了更大的变化，这反映了与其他两种急性酮症刺激(≤24小时)相比，生酮饮食诱导(1周)也许更能说明BHB氨基酸的积累效应。此外，苯丙氨酸、Lac-Phe和乳酸水平在三种刺激中并没有表现出一致的变化(辅图3D)；口服酮酯后，组织中BHB-Phe水平升高(辅图3E)。因此，BHB氨基酸是内源性的、酮症诱导的小鼠代谢产物。

4 .CNDP2和HMGCL对BHB-氨基酸的遗传调控

接下来研究人员展示了在已知生酮和酮分解代谢途径背景下，CNDP2依赖性酮体次级代谢途径示意图(图4A)。为了直接检测CNDP2对BHB-氨基酸生物合成的生理贡献，研究人员检测了接受酮酯饮料刺激或接受1周生酮饮食的CNDP2-KO小鼠血浆中BHB-氨基酸的含量。给予急性酮酯饮料后，CNDP2-KO小鼠血浆中多种BHB-氨基酸的减少超过90%(图4B)。接受1周生酮饮食的CNDP2-KO小鼠中也表现出多种BHB氨基酸的减少(图4C)。在以上两组实验中，WT和CNDP2-KO小鼠之间血浆BHB、乳酸或苯丙氨酸的水平都没有显著变化，而在CNDP2-KO小鼠中Lac-Phe水平的降低符合预期(辅图4A和4B)(小编注：酮酯饮料(Ketone ester drink，KE饮料)与葡萄糖饮料相比，KE饮料引起了显著的“生酮”效应(ketosis effect)能够快速升高血清中的BHB水平，同时饥饿感减少、食欲下降、饱腹感增加，并受胃饥饿素水平影响， KE饮料提供了一个无需饮食干预的独特的策略来模拟生酮饮食。有研究人员利用酮酯饮料进行临床实验研究，在临床上有一定程度的应用，有研究表明运动后，摄入KE饮料，可以显着减弱过度运动带来的生理症状，同时提高运动的耐力，减轻训练或空腹诱导的分解代谢事件；也有研究表明KE饮料能够降低血浆生长素释放肽水平、饥饿感和进食欲望，血酮水平升高可能会直接抑制食欲。另外也有研究发现，酮酯治疗对并发2型糖尿病的射血分数保留型心力衰竭患者的血液动力学产生了有益影响，通过补充酮酯使得长期升高的循环酮体上调酮体酶活性，减少血管纤维化，并改善心肌舒张功能和心脏重构。参考文献：[1]Stubbs BJ, Cox PJ, et al.Obesity (Silver Spring). 2018;26(2):269-273. [2]Poffé C, Ramaekers M, Van Thienen R, Hespel P. J Physiol. 2019;597(12):3009-3027. [3]Gopalasingam N, Berg-Hansen K, Christensen KH, et al. Circulation. 2024;150(20):1570-1583.)。

研究人员对CNDP2-KO小鼠中的有机酸-氨基酸结合物进行了代谢组学分析。N-乙酰苯丙氨酸(N-acetyl-Phe)、N-乙酰苯缬氨酸(N-acetyl-Val)、N-乙酰苯亮氨酸(N-acetyl-Leu)、N-乙酰甲硫氨酸(N-acetyl-Met)以及它们对应的游离氨基酸在WT和CNDP2-KO小鼠之间没有变化(图S4C)。N-丙基氨基酸(N-propyl-amino acids)、N-丁酰基氨基酸(N-butyryl-amino acids)或N-辛酰基氨基酸(N-octanoyl-amino acids)没有被检测到(C3、C4和C8)(辅图4C)，表明与乙酸、乳酸和BHB相比，相应有机酸在血循环中的丰度较低。（小编注：通过代谢组学分析证明其他类型的乙酰化氨基酸在WT和CNDP2-KO小鼠之间没有变化，说明CNDP2依赖的BHB-氨基酸生物合成并没有影响其他类型氨基酸的水平和乙酰化；并且长链脂肪酸（C3、C4和C8）修饰的氨基酸水平低，说明CNDP2影响的主要就是乙酸、乳酸和BHB修饰的氨基酸)。

接下来，研究人员探究了将肝脏生酮过程中的关键上游酶HMGCL特异性敲除所产生的影响(图4A)。在肝脏特异性敲除HMGCL基因小鼠(Alb-Hmgcl-/-小鼠，由Albumin-cre小鼠和Hmgclfl/fl小鼠杂交产生)的血浆中，BHB-Met、BHB-Leu和BHB-Val等几种BHB-氨基酸都减少了50%-80%，但BHB-Phe没有发生变化(图4D)。研究人员证实与Hmgclfl/fl小鼠相比，Alb-Hmgcl-/- 小鼠血浆中BHB水平降低30%，同时乳酸、Lac-Phe或苯丙氨酸水平没有变化(辅图4D)。总之，这些数据证明了HMGCL和CNDP2两种上游酶在循环BHB氨基酸水平调节中的遗传和生化必要性。（小编注：原文中强调是HMGCL作为肝脏生酮产生酮体这一过程中上游调控酶的作用，HMGCL敲除后主要影响了BHB的产生，所以在这一条件下几种BHB-氨基酸都显著减少了；但是BHB-Phe没有发生变化，可能说明CNDP2是负责BHB-Phe合成关键酶，BHB-Phe合成主要受到CNDP2的调控，所以在CNDP2存在的情况下，尽管敲除了HMGCL，BHB-Phe依然可以维持在一定水平)。

5.BHB-Phe在摄食行为和体重调节中的作用

BHB-Phe是含量最丰富的BHB-氨基酸(图3E)。该代谢物是Lac-Phe的同系物，两者具有相同的化学性质以及共同的CNDP2依赖性生物合成途径。因此，研究人员认为BHB-Phe与Lac-Phe具有相似功能，能够调节食物摄入和体重。研究人员首先使用功能获得性方法来确定BHB-Phe是否足以降低摄食量和体重。对处于代谢笼检测系统中饮食诱导肥胖(DIO)小鼠进行研究发现，单次腹腔注射BHB-Phe(50 mg/kg)减少了食物摄入量，而不影响小鼠运动、耗氧量或二氧化碳产生(图5A-5E)；同时表现出呼吸交换率(RER)的降低，这与食物摄入量降低保持一致(图5E)（小编注：以上都是在小鼠腹腔注射后10小时内测定的数据)。在以上条件下，血浆BHB-Phe水平在第1小时达到峰值20mM，并在第3小时恢复到基线值(辅图5A)。研究人员发现BHB-Phe注射后，DIO小鼠在不影响水摄入的情况下减少了摄食量，表明DIO小鼠建立了特异性的对食物摄入抑制(辅图5B)。并且在小鼠注射BHB-Phe后，血浆中其他调节激素，如胃饥饿素、瘦素和GDF15水平未发生改变(辅图5C)。

接下来研究人员在DIO小鼠中进行了BHB-Phe的慢性研究。每天腹腔注射BHB-Phe(50 mg/kg/day)可以持续抑制小鼠每日食物摄入，并且抑制体重增加(图5F和5G)。实验结束时，BHB-Phe处理的小鼠表现出天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)和总甘油三酯(TGs)的降低；高密度脂蛋白(HDL)-胆固醇或低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇没有变化(辅图5D)。接受BHB-Phe处理的小鼠与配对喂养小鼠的进食量相同且低于对照溶剂组小鼠，BHB组和配对喂养组的体重减轻量一样，说明进食量减少是BHB-Phe介导体重减轻的主要原因(小编注:pair-fed通常称为配对喂养，是指在实验组之外，通常用于动物研究中，特别是在研究饮食对生理或行为影响的研究中，设置一组实现一对一配对并且控制喂食量，使得配对喂养组的动物和实验组的动物吃一样重量的饲料,饲料的含量和成分可不同, 以此来控制食物摄入量的变量，并且通常是实验组和配对喂养组的饮食除观察的某一特殊成分不同,蛋白含量、热量均相同的,更有利于模型和药物的分析) (图5H)，表明抑制摄食是BHB-Phe导致小鼠体重变化的原因。

为了了解BHB-Phe的结构性特征对其减肥效果的影响，研究人员检测了与其结构相关的代谢物的作用。已知腹腔注射BHB-Phe(50 mg/kg/day)能够有效抑制DIO小鼠的体重和摄食量，但在相同剂量下，单独使用BHB或苯丙氨酸都没有影响(图5I)。并且腹腔注射相关代谢产物BHB-Lys(50 mg/kg )以及二肽Phe-Phe(50 mg/kg)和Leu-Leu(50 mg/kg)都未能减少小鼠摄食量或体重(图5J和5K)。研究人员又检测了其他受CNDP2调控的BHB结合物，包括BHB-Met、BHB-Leu和BHB-Val。这些代谢物由BHB与疏水氨基酸结合形成，其中BHB-Leu和BHB-Val代表与支链氨基酸结合的BHB(BHB-BCAAs)。研究人员观察到BHB-Met、BHB-Leu和BHB-Val都具有减肥效果(辅图5E)。因此，BHB-Phe和其他受CNDP2调控的BHB-疏水氨基酸结合物(包括BHB-BCAAs)在小鼠体内具有抗肥胖作用（小编注：BCAA本身并没有直接的抗肥胖作用，体内BCAA及其代谢物的增加与肥胖相关代谢疾病呈正相关，高BCAA饮食可加重肥胖，低BCAA饮食能改善肥胖。参考文献：Ma QX, Zhu WY, Lu XC, et al. Nat Metab. 2022;4(1):106-122.），而BHB与其他必需氨基酸(如BHB-Lys)结合物以及与其他二肽结合物则没有表现出相同的生物活性。

最后，研究人员利用CNDP2-KO小鼠来研究BHB-氨基酸对能量平衡的生理贡献。研究人员先前报道了Cndp2基因与糖酵解刺激之间的基因-环境相互作用：CNDP2-KO小鼠接受标准高脂肪饮食喂养后体重正常；然而，在糖酵解刺激下(通过跑步机运动或二甲双胍治疗)增加Lac-Phe水平（小编注：通过跑步运动或二甲双胍（二甲双胍是线粒体复合物I的直接抑制剂，能够抑制细胞呼吸）快速消耗氧气，使细胞处于缺氧条件下，促进糖酵解，糖酵解过程中产生的丙酮酸可以被还原为乳酸，增加了机体中乳酸含量，进而增加Lac-Phe水平，与WT相比，KO小鼠表现出摄食量和体重增加的表型。为了确定BHB-氨基酸的作用，在初始实验中，研究人员给WT和CNDP2-KO小鼠(经高脂饮食喂养11-19周诱导的肥胖模型)灌胃给予酮酯(3g /kg/day )（小编注：虽然HFD会导致胰岛素抵抗，促进血酮增加，但可能HFD带来的血酮水平升高浓度有限，而体外大量补充酮酯，还是可以在一定程度上影响小鼠体重的)。实验开始时，基因型小鼠之间体重没有差异。在12天酮酯治疗结束后，WT小鼠平均减少0.3±0.4g体重，而CNDP2-KO小鼠增加+1.0±0.2g体重(平均值±SEM，p<0.05，图5L)。CNDP2-KO小鼠也表现出比WT小鼠增加更多的摄食量(图5M)。在第二个实验中，研究人员让WT和CNDP2-KO小鼠接受生酮饮食。初始体重也没有差异，而实验结束后，生酮饮食的CNDP2-KO小鼠比WT小鼠体重增加更多，进食量也更多(辅图5F)。研究人员证实，Lac-Phe和BHB-Phe分别在跑步机运动和酮酯或生酮饮食处理后被单独诱导(辅图5G)。因此，以上研究揭示了Cndp2基因型小鼠对酮酯和生酮饮食诱导体重和食物摄入具有重要影响。

6.BHB-Phe激活下丘脑和脑干的神经群

为了更好地了解BHB-Phe抑制摄食的神经生物学机制，研究人员首先使用药理学和遗传学方法来确定BHB-Phe的作用是否由下丘脑黑素皮质素信号、胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)或脑干胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)家族受体α样(GFRAL)途径介导。腹腔注射BHB-Phe(50 mg/kg)对野生型或黑素皮质素4受体(MC4R)KO小鼠的摄食量和体重的影响相似(辅图6A和6B)。并且腹腔注射GLP-1R拮抗剂Exendin-3(0.1mg/kg/day, )有效阻断了腹腔注射GLP-1(2 mg/kg/day)的食欲抑制和抗肥胖作用（辅图6C和6D）；但是在同样Exendin-3注射情况下并没有改变BHB-Phe对摄食量和体重的影响(辅图6E和6F)。研究人员证明皮下注射GFRAL中和抗体(10 mg/kg)能够完全阻断皮下注射重组GDF15(4 nmol/k)抑制摄食和体重增长的作用(辅图6G)；但是BHB-Phe对小鼠摄食和体重的影响也不受GFRAL中和抗体的影响(辅图6H和6I)。因此，BHB-Phe对食欲抑制作用独立于这些已知的摄食控制途径。

接下来，研究人员使用活性依赖的遗传标记策略(TRAP，活性类群靶向重组工具)来鉴定BHB-Phe处理下激活的神经元。在BHB-Phe处理后，c-Fos依赖的重组报告盒(tdTomato)也能够实现BHB-Phe的永久遗传标记。研究人员采用腹腔注射BHB-Phe(50mg/kg)处理TRAP2小鼠(TRAP2/Rosa26-LSL-tdTomato)，在30min后注射4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)，以启动BHB-Phe激活的神经元中Cre依赖性重组。2周后，同样的小鼠接受腹腔注射Lac-Phe(50mg/kg)，90分钟后处死并进行c-Fos免疫染色(图6A)。因此，这种实验方法可以在同一动物中同时识别BHB-Phe激活的(tdTomato标记的TRAP+)和Lac-phe激活(c-Fos+)的神经元。研究人员检测了多个下丘脑和脑干区域的TRAP+或c-Fos+神经元。与对照组相比，BHB-Phe和Lac-Phe都激活了多个脑区的神经元群，包括下丘脑室旁核(PVH)、视交叉上核(SCN)、下丘脑背内侧核(DMH)、下丘脑腹内侧核(VMH)、下丘脑弓状核(ARH)、下丘脑外侧核(LH)、外侧臂旁核(LPBN)和孤立束核(NTS)(图6B)。对每个区域的TRAP+神经元和c-Fos+神经元的详细分析显示，只有一小部分神经元(2%-30%)同时被BHB-Phe和Lac-Phe激活(TRAP+/ c-Fos+)，而绝大多数激活的神经元是不同标记的(图6C)。图6D中展示了指示脑区的代表性截面。由于TRAP重组和c-Fos免疫反应可能对标记激活的神经元具有不同的敏感性，研究人员在TRAP2/Rosa26-LSL-tdTomato小鼠的独立队列中重复了该实验，但是调换了注射BHB-Phe/Lac-Phe顺序。在这个反向实验Lac-Phe激活的神经元被TRAP重组鉴定，而BHB-phe激活的神经元通过c-Fos免疫反应鉴定(辅图7A)。尽管Lac-Phe和BHB-Phe都激活了下丘脑和脑干的神经元群(辅图7B)，但对每个区域的详细分析表明，激活的两个神经元群在很大程度上是不同的(辅图7C)。因此，BHB-Phe药理学给药以不完全相同于Lac-Phe的方式激活了参与摄食行为的多个下丘脑和脑干区域。

通过活性类群靶向重组工具(targeted recombination in active populations，TRAP)能够实现活性神经集群的永久性标记。TRAP系统使用早期基因Fos位点来驱动他莫昔芬诱导的Cre 重组酶（CreER）的表达，并且能够诱导转基因或病毒递送的 Cre 依赖性效应子的表达。正常情况下刺激活化的神经元表达CreERT2被锁定在细胞质，当神经元在他莫昔芬存在下活跃时，CreER可以进入细胞核催化重组导致效应子的永久表达，进行特定时间区间内活性神经元集群的标记。相比于TRAP1，TRAP2保留了内源性的Fos启动子以保留神经元固有的Fos表达，并用iCreERT2代替原有的CreERT2元件以提高表达量，更重要的是在各脑区的标记效率都显著提高（TRAP1基本只能标记部分皮层）。TRAP2的时间窗由iCreERT2控制，此元件是将人源雌激素受体融合改良Cre（iCre）元件所得的四羟基他莫昔芬（4-hydroxytamoxifen, 4-OHT）诱导性Cre。在神经元内无4-OHT时，表达Fos的神经元启动表达iCreERT2，但只游离在胞质中，TRAP2标记窗关闭；而在神经元内含有4-OHT时，表达Fos的神经元所表达的iCreERT2可与4-OHT结合入核，启动Cre/loxP，从而打使得Cre依赖的目的基因得到表达。

c-Fos属于即刻早期基因 (immediateearly gene，IEG)，是一种即早期反应基因编码的核蛋白，做为原癌基因的一种，它在包括人类、大鼠、小鼠等多物种中都有表达，并且可在神经元中富集表达。当神经元受到刺激或激活时，c-Fos基因会被迅速诱导表达，并且能够发生二聚化形成激活蛋白1 (AP1) 复合物，作为转录因子起作用。由于c-Fos的表达不依赖于蛋白质合成，依赖于转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB，Cyclic adenosine monophosphate)和血清应答因子(SRF，serum response factor)，所以可迅速由细胞外刺激诱导，因此可以作为神经元激活的标记物。通过检测c-Fos的表达水平，可以了解神经元的激活状态，进而研究神经元的兴奋性、突触传递以及神经精神性疾病的发生和发展。MAPK / ERK途径可以激活核糖体S6激酶（RSK）。RSK是丝氨酸/苏氨酸激酶，参与信号转导的蛋白激酶家族成员。它有两个亚家族，分别是p90rsk(MAPK活化蛋白激酶-1（MAPKAP-K1）)和p70rsk(S6激酶)。其中p90rsk能够通过调节转录因子cAMP反应元件结合蛋白（CREB），使其发生磷酸化激活，并结合在c-Fos的启动子区域，促进c-Fos的表达。

参考文献：

[1]Tasaka GI, et al. Neuron. 2020;107(3):566-579.e7. 

[2] Lacroix C, Giovannini D, Combe A, et al. 2011;6(9):1412-1428.

7.人类CNDP2酶活性和BHB-氨基酸的保守性

研究人员试图了解人体中CNDP2依赖的氨基酸发生BHB酰化途径的保守性。首先，研究人员纯化获得的重组人CNDP2，能够以BHB和苯丙氨酸为底物发挥催化合成作用，表现出预期的体外BHB酰化活性(图7A)。随着BHB浓度的增加，米氏反应动力学也表现出与小鼠CNDP2酶相似的底物亲和力和最大速率(图7B)。接下来，研究人员鉴定了三种表达hCNDP2的人类细胞系：U937巨噬细胞、Caco-2肠道上皮细胞和PANC-1胰腺导管细胞。对于每一种人类细胞系，研究人员通过CRISPR-Cas9技术构建了以上三种人类细胞的对照和hCNDP2-KO细胞系。通过蛋白免疫印迹技术，研究人员验证了hCNDP2的完全缺失(图7C-7E)。在每个细胞系中敲除hCNDP2导致细胞裂解物BHB-氨基酸的合成活性几乎完全消失。这些数据表明，在人类细胞中存在主要由CNDP2调控的内源性氨基酸BHB酰化活性(图7C-7E)。研究人员为了确定BHB-氨基酸是否为人体内源性代谢物，测定了外源性酮补充试验中部分参与者血浆中BHB-氨基酸水平。受试者禁食过夜(>8h)后饮用酮酯饮料(0.3g/kg HVMN酮酯)（小编注：受试者禁食过夜是为了避免其他食物对实验的影响，小鼠HFD是为了看酮酯饮料是否在肥胖状态下起作用；与血酮水平升高关系不是很大，毕竟相对于内在血酮水平升高量来说，外来补充的酮酯量应该是更高量级的) ，1h后收集血浆。在基线血浆样本中能够检测到BHB-Phe、BHB-Leu、BHB-Val和BHB-Met，并且在饮用酮酯饮料后升高(图7F)。正如预期的那样，酮酯饮料增加了BHB的水平，而苯丙氨酸、Lac-Phe和乳酸的水平保持不变(图7G)。因此，CNDP2调控的氨基酸BHB酰化和BHB-氨基酸代谢物在人类中是保守的。

总结  

BHB是一种关键的酮体代谢物。迄今为止，所有已知的BHB代谢途径都涉及到BHB和初级能量中间体的相互转化。研究人员通过BHB和游离氨基酸的酶催化偶联(CNDP2依赖性的过程)，确定了BHB的次级代谢途径。这种BHB次级代谢途径产生一个抗肥胖的酮代谢产物家族，即BHB氨基酸。小鼠CNDP2基因敲除消除了组织氨基酸β-羟基丁酰化活性，并降低了BHB氨基酸水平。其中，最丰富的BHB氨基酸BHB-Phe是一种可诱导酮症的Lac-Phe同源物，激活下丘脑和脑干神经元并抑制摄食。相反，CNDP2-KO小鼠在外源性酮酯补充或生酮饮食后表现出食物摄入量和体重增加；CNDP2依赖性氨基酸BHB酰化和BHB-氨基酸代谢物在人类中也是保守的。因此，酶促氨基酸BHB酰化定义了与能量平衡相关的酮次级代谢途径和生物活性酮代谢物。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2024.10.032