代谢学人

Cell Metabolism ：VLDL的幕后推手

撰文 | 王颖雯 夏志蕊 闪光余 朱丽君 刘爽 曹玉香

编辑 | 孟美瑶

校对 | 朱丽君

背景介绍

在动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）中，载脂蛋白B（apoB）-脂蛋白水平的变化促进了疾病的发生发展（小编注：脂蛋白是由蛋白质、胆固醇、甘油三酯和磷脂所组成的球形大分子复合体，它们将肝中的甘油三酯、胆固醇和脂溶性维生素转运到外周组织，将外周组织的胆固醇转运回肝，血浆中的中性脂肪和类脂都需要脂蛋白运输。而脂蛋白中的蛋白部分称为载脂蛋白，是装配和构成脂蛋白所必需的，在激活脂蛋白代谢的关键酶及介导脂蛋白结合到细胞表面受体方面发挥作用，其中apoB是乳糜微粒、VLDL、IDL和LDL的主要结构蛋白）。血中apoB-脂蛋白主要来自肝细胞，在肝细胞中极低密度脂蛋白（VLDL）进行组装并且分泌进入体循环，而进入体循环的VLDL逐渐被水解形成中密度脂蛋白（IDL）和低密度脂蛋白（LDL）。目前临床上常用的CVD治疗药物主要有他汀类药物和蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）抑制剂，这两种药物都可以通过增强肝脏LDL受体（LDLR）介导的LDL清除功能来降低LDL水平（小编注：肝脏可以通过LDLR的内吞作用来摄取血液中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），降低动脉粥样硬化的风险。在哺乳动物中，LDLR在肝脏高度表达，介导清除70%以上的LDL-C，其中他汀类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶 HMG-CoA还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激LDLR使血清胆固醇清除增加，降低LDL-C，治疗动脉粥样硬化；而PCSK9抑制剂可以阻止LDLR降解，促进LDL-C的清除，降低LDL-C的水平）。

然而，这些药物都主要靶向LDLR清除LDL，对VLDL和IDL这些导致动脉粥样硬化的apoB-脂蛋白的影响较小，这会增加LDL-胆固醇水平控制良好人群的CVD患病风险（小编注：研究表明脂蛋白水平升高与CVD风险增加之间存在强大且特定的关联，VLDL、IDL、LDL这三种脂蛋白参与其中，目前市场上的CVD疗法能有效降低LDL-C，但临床上表明它们对VLDL和IDL的影响很小）。因此，通过抑制肝脏VLDL产生来抑制致动脉粥样硬化的apoB-脂蛋白水平，可能会有助于降低CVD风险。ApoB是一种大型的复合蛋白，是形成VLDL的结构支架。在肝细胞中，VLDL通过apoB脂质化过程将甘油三酯、胆固醇酯和磷脂结合到apoB上组装成球形颗粒。这个过程取决于脂质可用性和中性脂质转运体——微粒体甘油三酯转移蛋白（MTP）。MTP与肝细胞内质网（ER）中的apoB结合，将脂质转移到apoB上。当MTP不可用时，VLDL无法组装，新翻译合成的apoB被靶向降解。尽管已有研究证实了MTP在apoB脂质化中的重要作用，但是关于apoB-MTP相互作用的调节以及MTP介导的脂质向apoB转移的研究却很少。 

既往研究表明，血浆中组织型纤溶酶原激活物（tPA）活性降低与动脉粥样硬化性CVD的风险增加有关，但这种情况下的纤维蛋白溶解降低是否有助于CVD的发生尚不清楚。在tPA活性降低的人群中，低tPA活性可能通过升高apoB-脂蛋白胆固醇水平来促进CVD的发生。然而，apoB-脂蛋白代谢和tPA之间是否存在因果关系并不明确，且涉及的相关机制也仍不清楚。已知肝细胞在apoB-脂蛋白的产生中发挥核心作用，并且近期有研究表明，肝细胞在合成tPA和血浆tPA浓度维持以及发挥tPA纤溶作用中发挥着关键的作用，而肝细胞中tPA与apoB-脂蛋白组装和分泌之间的联系并不明确。 

近期发表在Science杂志上的一篇题为“Intracellular tPA-PAI-1 interaction determines VLDL assembly in hepatocytes”的文章证明了内源性肝细胞tPA通过与apoB的直接作用来限制VLDL的组装，阻断apoB与MTP之间的相互作用，从而抑制MTP依赖的中性脂质转移和apoB脂质化。本研究还发现纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI-1）可以与肝细胞内的tPA结合，从而阻断tPA对VLDL组装的抑制作用，并且体内相关数据表明，tPA与PAI-1的相互作用能促进生理性餐后VLDL的组装。因此，本研究发现tPA可以改变致动脉粥样硬化载脂蛋白的产生，对降低动脉粥样硬化性CVD风险具有潜在的治疗意义。

纤溶系统与动脉粥样硬化

血液凝固过程中形成的纤维蛋白被分解液化的过程，叫纤维蛋白溶解现象（简称纤溶），纤溶的激活物（纤溶酶原和纤维蛋白溶解酶即纤溶酶）和抑制物以及纤溶的一系列酶促反应，总称纤溶系统。

纤维蛋白溶解的基本过程可以分为两个阶段：纤溶酶原的激活与纤维蛋白的降解。正常情况下，血浆中纤溶酶原无活性，只有在激活剂的存在下才能转变为具有催化活性的纤溶酶。纤溶酶原的活化过程由两种激活剂完成，即组织型纤溶酶原激活剂（tPA）和尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA），两者的作用过程是完全不同的。tPA是一种活性酶而非酶原，在纤维蛋白凝块形成后迅速启动纤维蛋白溶解级联反应，与纤维蛋白的结合较强；而uPA是一种酶原，经纤溶酶激活后称为活性的uPA，通过正反馈机制加速纤溶酶的形成，与纤维蛋白亲和力较弱。纤溶酶一旦形成，就会裂解纤维蛋白和纤维蛋白原，生成D-二聚体和纤维蛋白降解产物。此外，凝血酶激活的纤溶抑制剂（TAFI）在被凝血酶、纤溶酶或凝血酶-血栓调节蛋白复合物活化后，可清除纤维蛋白中的羧基末端赖氨酸残基，从而减少纤溶酶的生成并稳定血栓中的纤维蛋白。

研究表明，血脂代谢能力异常、遗传变异、炎症反应与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关，但目前除了以上因素外，纤维蛋白原、低纤溶活性也与动脉粥样硬化发生有关。纤维蛋白原水平增加影响内皮细胞功能，同时刺激其合成、分泌纤溶酶原激活物抑制剂（PAI-1），造成血管壁局部形成微血栓，而且不能及时被体内的纤溶系统清除，导致血管壁内皮细胞损伤，从而促进动脉粥样硬化的形成和发展。

敲黑板啦！

1.肝细胞内降低tPA水平可使血浆apoB水平升高；

2.肝细胞tPA能够限制内质网中apoB的脂质化和apoB-VLDL的组装及分泌；

3.肝细胞tPA通过K2结构域与apoB相结合阻断MTP介导的apoB-VLDL的组装；

4.PAI-1与tPA结合阻碍tPA与apoB结合进而促进apoB-VLDL组装。

研究结果

1.肝细胞内tPA水平降低可使血浆apoB水平升高

在排除LDL受体肝脏清除率的影响下，为探究肝细胞tPA在血浆apoB-脂蛋白水平调控中的作用，研究人员对Ldlr-/-小鼠注射腺相关病毒8（AAV8）-H1-shPlat（sh-tPA），来实现肝细胞tPA的表达沉默，并对其饲喂含高脂、高胆固醇的西方饮食（WD）（小编注：即研究人员为了抑制肝细胞中的tPA表达，给小鼠静脉注射了含有shPlat的AAV8病毒（AAV8-H1-shPlat），年龄相同的小鼠注射AAV8-H1-scramble作为对照。其中H1启动子为III型启动子，主要表达非编码的短序列RNA，如sgRNA，shRNA，miRNA等。H1启动子本身不具有组织特异性，但是AAV8这种血清型对肝脏具有较强的亲嗜性，对小鼠肝脏感染具有较好效果，因此在文章中，研究人员也把使用此种干预方式沉默tPA基因的小鼠称为肝细胞tPA沉默小鼠。下文中的TBG启动子则是一种基于人甲状腺结合球蛋白启动子和微球蛋白增强子的混合型启动子，用于肝脏特异性转外源基因表达）。与注射AAV8-H1-scrambled RNA（scr）的小鼠相比，肝细胞tPA沉默小鼠的血浆总胆固醇水平高出47%，血浆apoB-100水平高出28%（图1A和图S1A）。通过快速蛋白液相色谱（FPLC）进行血浆脂蛋白组分分析，发现肝细胞tPA沉默小鼠的VLDL和LDL组分中含有更多的胆固醇和apoB-100，在VLDL中具有更多的甘油三酯（图1A）。在不同的高胆固醇血症小鼠模型的研究中，研究人员发现在WD喂养的Apoe基因敲除（Apoe-/-）小鼠中肝细胞tPA沉默导致血浆中总胆固醇和apoB-100的含量分别升高了56%和28%，同时也发现VLDL和LDL中胆固醇、甘油三酯和apoB-100升高（图1B和图S1B）；在WD喂养的野生型（WT）小鼠中也观察到了类似的结果（图S1C和图S2）。为了进一步验证肝细胞tPA在影响血浆apoB-脂蛋白水平中的作用，研究人员通过给Platfl/fl小鼠注射由甲状腺素结合球蛋白（TBG）启动子驱动表达Cre重组酶的AAV8-TBG-cre（Cre）来建立肝细胞tPA敲除小鼠模型。与AAV-TBG-GFP小鼠相比，WD喂养的肝细胞tPA敲除小鼠的血浆总胆固醇水平高出30%，血浆apoB-100水平高出33%，VLDL和LDL组分中的胆固醇和apoB-100更高，VLDL中的甘油三酯更高（图1C和图S1D）。在Ldlr-/-、Apoe-/-、WT三种小鼠模型中（小编注：Ldlr-/-和Apoe-/-敲除小鼠是动脉粥样硬化实验研究中最常用的两种动物模型，小鼠缺失ApoE时血液中TC、LDL、VLDL含量都会增加，缺失LDLR会导致其体内IDL、LDL和乳糜微粒浓度提升，都会增加动脉粥样硬化发生的风险），肝脏的Apob mRNA的表达水平并没有因为肝细胞tPA沉默而发生变化（图S3），这一结果表明血浆apoB水平升高并不是由于apoB合成增加导致的。除此之外，因为血浆apoE水平和肝脏LDLR表达保持不变，血浆apoB水平变化也不是apoE或LDLR通路介导的结果（图S4A和图S4B）。总之，这些结果表明肝细胞tPA沉默是通过独立于LDLR和apoE的机制来提高血浆apoB-脂蛋白胆固醇水平的。为了进一步验证肝细胞的内在效应机制，并将其与人体内相关效应机制紧密联系在一起，研究人员使用针对PLAT mRNA的小干扰RNA（si-tPA）使人原代肝细胞中tPA表达沉默。与对照组肝细胞（scr）相比，si-tPA处理过的细胞培养基中apoB-100水平较高（图S5A和图1D），而两组细胞中肝细胞Apob mRNA水平相似（图S5B）。此外，从沉默tPA表达的人肝细胞培养基中分离的VLDL组分，发现胆固醇和甘油三酯的含量较高（图1D）。同时在大鼠肝癌细胞系McA-RH7777细胞中也观察到类似的结果（图1E、图S5C和图S5D）。以上数据表明，tPA调节apoB-脂蛋白分泌的能力是肝细胞的固有属性，也适用于人类肝细胞。

图1 沉默肝细胞tPA独立于LDLR或apoE途径增加apoB-脂蛋白胆固醇和apoB

辅图1 沉默肝细胞tPA表达可降低小鼠血浆tPA水平

辅图2 肝细胞tPA沉默可增加野生型小鼠血浆apoB-脂蛋白胆固醇和apoB

辅图3 肝细胞tPA沉默不改变小鼠肝脏Apob mRNA的水平

辅图4  肝细胞tPA沉默不改变血浆apoE和肝脏LDLR水平

辅图5  肝细胞tPA沉默不会改变Apob mRNA的水平

apoB相关的脂蛋白代谢过程

脂蛋白是由脂质和蛋白质组成的复合物，根据分子沉降率可以将其分为四类，密度由低到高分别为：乳糜微粒，VLDL，LDL，HDL。其中脂蛋白的蛋白质成分称为载脂蛋白，主要包括：apo-A、B、C、D及E五大类。apoB根据氨基酸序列不同可分为apoB-48和apoB-100，apoB-48是乳糜微粒的特征载脂蛋白，而apoB-100是VLDL重要的结构蛋白。

在体内处理脂蛋白的过程被称为“脂蛋白代谢”，主要分为两种途径，分别是内源性途径（由肝脏产生）和外源性途径（膳食摄入）。由在小肠粘膜细胞合成的甘油三酯与合成和吸收的磷脂、胆固醇，加上apoB-48、apoAI、apoAII、apoAIV等组装后形成新生乳糜微粒，并由肠上皮细胞分泌。随后经过淋巴道进血从HDL获得apoC、apoE后形成成熟乳糜微粒（CM），CM在血浆中循环时，apoCII可以激活脂蛋白脂肪酶（LPL），使CM中的TG及磷脂逐渐水解，产生甘油、脂肪酸及溶血磷脂，被心肌、骨骼肌、脂肪组织及肝组织摄取利用。被水解的乳糜微粒被称为乳糜微粒残体，这些残体会继续在血液中循环下去，直到在apoE的帮助下与肝细胞膜上的apoE受体相互作用，吞噬入肝细胞，与细胞溶酶体融合，载脂蛋白被水解为氨基酸，胆固醇酯分解为胆固醇和脂肪酸，进而可被肝脏利用或分解。

而肝脏分泌的apoAI通过ATP结合盒转运体1（ABCA1）接受外周细胞内磷脂和游离胆固醇，形成小的盘状HDL，随后卵磷脂胆固醇酰基转移酶LCAT介导胆固醇脂酯化，产生球形的HDL，而磷脂转移蛋白（PLTP）可以参与HDL颗粒的脂质交换。另一方面，主要在肝脏产生的VLDL分泌入血后，也接受来自HDL的apoC和apoE，apoCII激活LPL，催化甘油三酯水解，VLDL颗粒逐渐缩小转化为VLDL残粒（也称为IDL），IDL可以通过肝细胞膜上的apoE受体而被吞噬利用，也可以被肝脂酶（HL）水解为LDL。

2.tPA限制内质网中apoB的脂质化

对Ldlr-/-和Apoe-/-小鼠模型中的数据进行分析，结果表明tPA能够减少apoB-脂蛋白的产生。非离子表面活性剂去垢剂泊洛沙姆407（P407）注射液能够通过抑制脂蛋白脂酶活性和VLDL脂解作用来阻断VLDL的清除，研究人员进一步探究了肝细胞tPA沉默对注射P407小鼠的VLDL分泌的影响。肝细胞tPA沉默的小鼠注射P407之后甘油三酯升高更快，这表明VLDL生成增加（图2A）。并且肝细胞来源的血浆apoB–100的增加比小鼠肝细胞和肠上皮细胞产生的血浆apoB-48增加的程度更大（图2B）（小编注：apoB由于氨基酸组成的差异，可以分为apoB-48和apoB-100。apoB-48主要存在于乳糜微粒中，是乳糜微粒中最重要且不可交换的载脂蛋白，主要由小肠合成。而apoB-100在乳糜微粒、VLDL、IDL中均存在，主要由肝脏合成）。以上研究结果表明沉默肝细胞tPA能够通过促进VLDL产生来增加血浆apoB-脂蛋白水平。

ApoB脂质化水平是决定肝内apoB去向的关键因素。脂质化程度低的apoB在细胞内发生降解，而完全脂质化的apoB可以作为具有较大尺寸且密度较低的VLDL颗粒被有效地分泌到细胞外。通过密度超速离心法分离得到的血浆VLDL颗粒电镜扫描结果显示，肝细胞tPA沉默的Ldlr-/-小鼠血浆VLDL颗粒向直径更大的颗粒转变（图2C）。通过动态光散射进行分析，得到的结果也验证了这一结论，sh-tPA小鼠比对照组小鼠的VLDL具有更大的直径（图2D）。这些数据表明tPA沉默小鼠的VLDL具有更高的脂质含量，这也进一步验证了tPA沉默小鼠的VLDL具有更高的甘油三酯/apoB比值（图2E）。

为了探索体内肝细胞tPA表达增加对血浆apoB-脂蛋白的影响，研究人员给全身tPA敲除小鼠（holo-tPA-KO）注射AAV8-TBG-Plat（tPA）恢复tPA在肝细胞中的特异性表达，同时注射AAV8-TBG-LacZ（LacZ）作为对照。正如预期，与AAV8-TBG-LacZ组相比，AAV8-TBG-Plat组小鼠血浆中apoB-100、VLDL-胆固醇和LDL-胆固醇水平更低（图2F）。

为了探究小鼠肝细胞产生的脂蛋白与人肝细胞产生的脂蛋白是否具有相关性，研究人员用编码tPA的质粒转染人原代肝细胞，并使用3[H]-亮氨酸脉冲追踪法检测细胞中apoB的分泌，结果显示细胞培养基中与apoB相关的放射性降低，这表明新合成的apoB分泌减少（图2G）。相反，在si-tPA处理的肝细胞中发现，新合成的apoB分泌增加（图2H），同时在tPA干扰的McA-RH7777大鼠肝癌细胞中也观察到类似的结果（图S6）。然而，用重组人源tPA处理人原代肝细胞并未改变培养基中apoB-100水平以及VLDL中胆固醇和甘油三酯含量（图S7），这表明肝细胞tPA限制了细胞内apoB脂质化。

与上述小鼠血浆数据结果一致，沉默tPA增加了细胞培养基中的VLDL的直径和甘油三酯/apoB比值（图2I和图2J）。这些数据表明，沉默tPA的确促进了apoB的脂质化。ER是apoB脂质化和VLDL组装的主要位点，并且apoB的脂质化程度可以通过apoB脂蛋白颗粒的密度来确定，即apoB的脂质化程度越高，颗粒的密度越低。与对照组肝细胞相比，tPA沉默的人原代肝细胞具有更高水平的ER相关apoB-100水平，并且在低密度组分中具有更高的apoB-100比例（图2K）。这些结果表明apoB密度与脂质化程度呈负相关，进一步支持了肝细胞tPA能够限制内质网中apoB脂质化的假设。

图2  tPA限制内质网中apoB的脂质化

辅图6  沉默tPA可增加McA-RH7777细胞的apoB分泌

辅图7  重组tPA处理人原代肝细胞不改变培养基中的apoB水平

3.tPA与apoB相互作用阻断MTP介导的VLDL组装

MTP是一种伴侣蛋白，主要将甘油三酯和胆固醇酯两种中性脂质转移并结合到apoB上以促进其在ER中组装VLDL，从而促进肝内apoB脂质化。抑制apoB-MTP的相互作用会减少apoB的脂质化和分泌，所以由MTP介导的脂质向apoB的转移过程中涉及MTP与apoB的直接结合。作者发现，在人原代肝细胞中沉默tPA并不改变MTP蛋白的水平（图3A）。然而，对免疫共沉淀实验结果进行分析，研究人员发现与对照组肝细胞的MTP免疫沉淀相比，tPA沉默肝细胞的MTP免疫沉淀显示出更高的apoB含量（图3A）。这些数据表明，tPA沉默促进apoB-MTP的相互作用，这可能促进了MTP将脂质转移到apoB上。为了验证以上假设，研究人员设计实验并证明了从tPA沉默的肝细胞中分离的微粒体组分的中性脂质转移活性是对照组细胞微粒体组分的中性脂质转移活性的两倍（图3B）。因为MTP的抑制剂CP-346086能够完全恢复tPA沉默的肝细胞微粒体中升高的中性脂质转移活性，证明这种脂质转移活性是由MTP引起的（图3B），同时也在McA-RH7777细胞中观察到类似的结果（图S8）。相反，当tPA在人原代肝细胞中过表达时，apoB-MTP相互作用和中性脂质转移活性降低（图3C和图3D）。除此之外，纯化的重组tPA蛋白能够以剂量依赖的方式减少MTP介导的中性脂质向LDL的转移（图3E）。因此，tPA能够抑制apoB-MTP相互作用，降低MTP介导的脂质转移活性。 

为了验证tPA与apoB的相互作用，研究人员对转染带有C末端HA标签的tPA的人原代肝细胞进行分析，结果发现apoB与tPA存在相互作用（图3F）。此外，研究人员使用标记的anti-tPA和anti-apoB在肝细胞中进行tPA-apoB亲和力分析实验，实验结果显示细胞内存在点状荧光，进一步验证内源性tPA与apoB存在相互作用（图3G）。研究人员还利用免疫荧光共聚焦显微镜观察到tPA和apoB共定位于内质网（图3H）。此外，由于tPA的C端的KDEL序列使tPA保留在内质网中，tPA-KDEL增加也减少了新合成的apoB的分泌（图3I）（小编注：内质网的正常驻留蛋白不管是在腔中还是在膜上，在其C端都有一段回收信号序列，即KDEL序列（Lys-Asp-Glu-Leu），如果这些蛋白意外逃逸进入转运泡到达高尔基体cis面，则cis面的膜结合受体蛋白会识别并结合逃逸蛋白的回收信号，形成COPI衣被小泡将其返回内质网）。总之，这些数据表明tPA与apoB在内质网中存在相互作用，这与tPA降低apoB-VLDL的组装和分泌有关。

tPA的蛋白酶活性依赖于第513位的丝氨酸残基，将丝氨酸替换为丙氨酸（S513A）可以完全消除tPA的丝氨酸蛋白酶活性。研究发现丝氨酸蛋白酶突变体tPA（S513A）能将人原代肝细胞分泌的apoB水平和MTP介导的脂质转移活性降低到与WT tPA相似的程度（图3I和图3J），这一结果表明tPA的脂质化作用与其蛋白酶活性无关。此外研究发现纯化的重组WT tPA和S513A-tPA与固定在微孔板表面的LDL或apoB-100均能以剂量依赖的方式直接相互作用（图4A，图S9和图S10）。相比之下，纯化的tPA与MTP没有相互作用（图4B）。关键的是将LDL与tPA预先孵育可抑制LDL与MTP的结合（图4C）。表面等离子共振技术（SPR）结果表明tPA与LDL之间存在非共价相互作用（图4D）。这些数据表明，tPA以不依赖tPA蛋白酶活性的方式结合apoB，同时阻断了apoB与MTP的相互作用，从而减少了apoB的脂质化和VLDL的组装和分泌。

图3  tPA阻断apoB-VLDL组装

辅图8  沉默tPA增加McA-RH7777细胞中MTP依赖的脂质转移

辅图9  通过排阻色谱法纯化人重组tPA和LDL

辅图10  tPA与分离的apoB-100相互作用

4.tPA的K2结构域与apoB的N端发生相互作用

已知tPA的K2结构域具有赖氨酸结合位点，是tPA与纤维蛋白发生相互作用所必需的。在人源tPA的K2结构域中，带负电荷的236位和238位天冬氨酸残基负责与带正电荷的赖氨酸残基的结合，而apoB表面暴露在外的N端有一个带正电荷的赖氨酸富集区能够与MTP结合。通过使用包含474至539位氨基酸的人源apoB片段对小鼠进行免疫接种产生的单克隆抗体1D1可以部分阻断apoB N末端的MTP相互作用区域（第430~570位氨基酸）。在这样的条件下，研究人员证明1D1能抑制tPA与LDL之间的相互作用，而针对人apoB第4031至4080位氨基酸（α3结构域）的表位对照抗体并不能发挥相应的抑制作用（图4E）。这些数据表明tPA与apoB的N端存在相互作用。

研究人员使用缺乏K2结构域的tPA突变体（tPA-Δ-K2）和将236位和238位天冬氨酸残基替换为天冬酰胺（tPA-D236 ,238N）的tPA突变体进行脉冲追踪试验，发现tPA降低apoB分泌的能力被阻断（图4F）。同样，研究人员在固相蛋白结合实验中发现，作用于tPA K2结构域的抗体能抑制tPA与LDL的结合（图4G）。此外，研究人员还发现，使用抑制tPA与纤维蛋白结合的赖氨酸类似物氨甲环酸（TXA）（小编注：氨甲环酸是一种人工合成的赖氨酸衍生物，经过竞争性结合纤溶酶上的赖氨酸结合位点，从而抑制纤维蛋白的分解、降低纤溶活性，进而发挥纤溶、止血的作用）能够部分减少tPA与LDL之间的相互作用（图4H和图S11）。综上所述，tPA的K2结构域在236位和238位天冬氨酸残基处有赖氨酸结合位点，能够与apoB N末端的赖氨酸富集区域发生结合（图4I）。

图4  tPA的K2结构域与apoB的N端相互作用

辅图11  TXA部分降低了tPA与LDL的相互作用

5.PAI-1在肝细胞中将tPA与apoB分隔

通过口服增加循环肠道中的apoB-48脂蛋白可促进人肝脏VLDL的生成，但其具体调节机制仍不清楚。通常肥胖与血脂异常相关，同时可以增加肝细胞tPA合成，然而，tPA的丝氨酸蛋白酶抑制剂PAI-1（小编注：PAI-1 基因是完全纤溶酶原激活物抑制剂1，是编码丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的成员。该成员是组织纤溶酶原激活物（tPA）和尿激酶（uPA）的主要抑制剂，该基因位于7号染色体上）的大量增加会过度补偿tPA的增加，导致肝脏和血浆中的游离tPA含量下降。PAI-1与tPA能共价结合形成稳定的复合物，研究人员据此做出假设：餐后肝细胞脂质负荷会增加tPA与PAI-1细胞内相互作用，导致游离tPA减少，而游离tPA的减少将促进apoB-MTP相互作用，导致VLDL组装和分泌增加。

研究人员首先在人原代肝细胞的PAI-1免疫沉淀物中对tPA进行免疫印迹，发现了一条约120kD的条带，这代表着tPA（约70 kD）和PAI-1（约50 kD）共价结合形成的十二烷基硫酸钠（SDS）稳定复合物（图5A）。通过使用抗tPA和PAI-1抗体的PLA技术（小编注：PLA（Proximity Ligation Assay）技术，即邻近连接技术，是一种特殊的免疫分析方法，可用于检测目标蛋白，蛋白相互作用等等。该方法通过一对标记有一段寡聚脱氧核苷酸（单链DNA）的单克隆或者多克隆抗体的探针，即PLA probe（探针），识别目的蛋白，当这两个探针识别同一个蛋白时，两个探针之间的距离靠近，产生邻近效应（proximity），再通过加入一段分别与连接在抗体上的DNA互补的连接寡聚脱氧核苷酸，PLA probe上的DNA就会通过配对互补作用，与该段DNA互补，然后在连接酶的作用下，PLA probe上的片段DNA被连接在一起形成一条新的DNA片段，通过荧光PCR可以扩增并对该新的DNA片段进行定量，从而对应的定量目标蛋白）测定进一步验证了这种相互作用的存在（图5B）。油酸盐能刺激apoB脂质化和VLDL产生，用油酸盐处理人原代肝细胞1小时后可以观察到tPA-PAI-1复合物增加和游离tPA减少（图5C和图5D）。因此，tPA-PAI-1复合物在油酸盐处理后的肝细胞内迅速形成，并且随着油酸盐处理时间的延长，游离tPA进一步减少，同时伴有tPA-PAI-1复合物的持续增加（图5D）。这些结果表明，当肝细胞负载脂质时，PAI-1与tPA的相互作用参与对apoB脂质化和VLDL生成的调控。 

研究人员通过脉冲追踪法对人原代肝细胞进行分析，发现对PAI-1进行沉默之后将会产生更多的游离tPA和更低的apoB分泌。在油酸盐处理的情况下，肝细胞PAI-1沉默对apoB分泌的抑制作用更为显著，游离tPA增加约400%，apoB分泌减少约60%。相比之下，在没有油酸盐处理的情况下，游离tPA仅增加约67%，apoB分泌减少约25%（图5E和图5F），同样在McA-RH7777肝细胞中也能观察到类似的结果（图S12）。这些观察结果与以下假设一致：在基础条件下，大多数tPA以游离形式存在，不被PAI-1结合，因此PAI-1沉默导致游离tPA的适度增加和apoB分泌的适度减少。然而，随着油酸盐的负荷增加，更多的tPA被结合到PAI-1上，此时沉默PAI-1将导致游离tPA的大量增加和apoB分泌的大量减少。除此之外，与单独沉默tPA相比，同时沉默tPA和PAI-1并不会降低apoB的分泌（图5G）。这些数据进一步证明PAI-1能够通过将tPA与apoB分隔从而促进apoB发生脂质化。

tPA与PAI-1结合形成复合物会改变tPA的构象，使tPA失去结合纤维蛋白的能力，并且tPA的构象改变是由tPA的K2结构域中赖氨酸结合位点介导的。因此，研究人员做出推断，PAI-1与tPA的结合能够阻断K2结构域中的赖氨酸结合位点，从而进一步阻断tPA-LDL的相互作用，并且PAI-1-tPA复合物无法与LDL结合，不能抑制MTP介导的中性脂质转移活性（图5H和图5I）。 

为了进一步在体内验证这一推测，研究人员将橄榄油通过灌胃的方式输送到小鼠体内（小编注：油脂中的TG通过小肠乳糜微粒吸收入血，血里的TG会被LPL分解进入体内，而VLDL是运输内源性TG的主要形式）。灌胃2小时和6小时后，肝脏中游离tPA的水平相比与基础水平较低（图5J），而肝脏总tPA和PAI-1水平没有变化（图S13）。这些数据表明，肝细胞在脂质负荷后，肝细胞tPA-PAI-1相互作用在apoB脂质化水平的调节中发挥一定功能。正如研究人员所预测，肝细胞PAI-1敲除小鼠具有更高的肝脏游离tPA和更低的血浆apoB、总胆固醇以及VLDL和LDL组分中的胆固醇（图6A-D）。与在肝细胞tPA沉默小鼠中较高的VLDL水平相反（图2A），肝细胞PAI-1敲除小鼠在注射P407后甘油三酯含量上升缓慢，表明VLDL产生水平较低（图6E）。此外，小鼠灌胃橄榄油2小时后，对照组小鼠血浆apoB-100升高46%，而肝细胞PAI-1敲除小鼠血浆apoB-100仅升高13%（图6F）。以上结果表明，内源性肝细胞PAI-1通过与tPA相互作用并同时将tPA与apoB相分隔，进一步促进了肝脏内VLDL含量生理性增加。

图5  PAI-1将tPA与apoB分隔导致肝细胞内VLDL组装增加

辅图12  沉默PAI-1可减少McA-RH7777细胞的apoB分泌

辅图13  口服橄榄油不改变小鼠脏总tPA和总PAI-1水平

6.PAI-1缺陷的人类具有较低的apoB-胆固醇水平

研究人员收集了PAI-1编码基因SERPINE1纯合子功能缺失突变的人血浆样本，并将其与来自同一社区的年龄、性别和BMI匹配的对照个体血浆进行比较。所有受试者均未服用降脂药物或有已知的心血管疾病史。PAI-1缺陷者血浆LDL-胆固醇含量降低了22%，apoB-胆固醇含量降低了17%，VLDL-胆固醇含量降低了18%（图6G）。同时与对照组相比，PAI-1缺陷的个体在VLDL中具有更高的tPA水平（图6H），并且VLDL相关tPA水平与VLDL直径呈负相关（图6I）。这些数据结果与肝细胞PAI-1敲除小鼠和PAI-1沉默的人原代肝细胞（图5F和图6D）的数据一致，表明PAI-1敲除导致肝细胞中游离tPA水平升高，使更多的tPA与apoB发生相互作用，从而限制apoB的脂质化和VLDL的产生。

综上所述，tPA能够直接与肝细胞内质网中的apoB发生相互作用，并且这种相互作用能降低MTP介导的VLDL组装。当肝细胞内有脂质负荷时可诱导tPA-PAI-1复合物形成，使tPA与apoB相分隔，从而促进apoB脂质化和VLDL组装（图6J）。

图6  PAI-1缺乏导致小鼠和人血浆apoB和apoB-胆固醇浓度降低

总结

在本文中，研究人员揭示了肝脏tPA对血液胆固醇水平的重要影响，强调了肝脏和血管之间的关键联系。在肝细胞内，tPA在VLDL的组装过程中起着重要作用，特别是与MTP之间的相互作用。此外，研究人员还发现，血液中的PAI-1水平与tPA活性和胆固醇水平之间存在相关性，较高水平的PAI-1会降低tPA与apoB蛋白结合，进而促进apoB的脂化和VLDL的组装。本文建立了tPA、PAI-1和致使动脉粥样硬化apoB脂蛋白的血浆水平之间的联系，打破了传统认知中，tPA和PAI-1在动脉粥样硬化血管疾病中的作用。这些发现为CVD患者中高apoB胆固醇和低tPA之间的相关性提供了新的见解。此外，这项工作提出了独立于LDLR的治疗策略，以降低心血管风险。（小编注：目前治疗动脉粥样硬化血管疾病的方式是可以针对LDLR进行靶向治疗，本文中发现了tPA与PAI-1在动脉粥样硬化中的作用，可以将tPA与PAI-1作为新的治疗靶点。正常情况下，血液凝固会及时被纤维蛋白溶解, tPA与PAI-1处于动态平衡状态，但是当出现血脂代谢能力异常、遗传变异、炎症反应等风险情况时，刺激PAI-1水平和活性增加，进一步引起的纤溶能力降低（促进血栓的形成和发展），因此如果针对tPA或PAI-1进行靶向治疗，有可能会对血栓形成产生影响。）

原文链接：https://doi.org/10.1126/science.adh5207

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