“最近出现的抗生素耐药性重新引起人们对幽门螺杆菌疫苗开发的兴趣，但是其复杂的免疫致病机制仍是成功开发疫苗的阻碍。”

运用生物信息学和免疫组学推进幽门螺杆菌疫苗的开发(译文)

1．问题

幽门螺杆菌在人群中感染胃粘膜的比率为50%，并可导致所有感染人群患慢性胃炎，其中相当数量的人群还会出现严重的临床不适症状。虽然大多数革兰氏阴性菌感染不会造成这些症状，但人群在感染后的数十年内最终会有约10%的人出现胃和十二指肠溃疡，甚至1%的人会罹患胃粘膜相关淋巴组织腺体癌或淋巴瘤。幽门螺杆菌的感染分布是不均匀的,在资源贫乏的国家最普遍(感染率从70%到90%)，而在一些西方国家只有10%或更少。应用幽门螺杆菌基因组学开发疫苗的进展在有效的抗生素疗法出现后有所放慢。不幸的是，多种药物治疗方案目前并不能彻底根除大部分病人的感染，也不能预防重复感染，而且致病菌的耐药株越来越普遍。

最近出现的对抗生素疗法的抵制重新引起了开发抗幽门螺杆菌疫苗的兴趣，但是其复杂的免疫致病机制阻碍了疫苗的成功研发。幽门螺杆菌可引发机体对抗感染的强烈的炎症反应，包括多种先天和继发性免疫细胞群向胃部的聚集。其后宿主将终身伴随持续感染，这也证明这种细菌可以成功躲避宿主的自然防御挑战。大多数证据显示分泌IFN- 的CD4+细胞发起最初的促炎反应，最终被表达 FoxP3的 CD4+CD25 高调节性T 细胞缓解。因此，病原体未能被根除，加之持续性感染，最终发展为慢性胃炎。无论用于预防还是治疗，一种成功的疫苗必须保持Th1免疫反应在免疫系统中占主导地位，从而克服由幽门螺杆菌诱导的调节性T细胞的免疫抑制特性。尽管全灭活幽门螺杆菌疫苗、表达幽门螺杆菌蛋白的细菌载体疫苗及重组亚单位疫苗可在体液免疫或细胞介导免疫中发挥作用，但它们均未在临床试验中显现出保护性免疫作用。我们需要一种新的疫苗设计方案，来克服传统方式的局限性。

2．有希望的解决方案

基因组学和计算机领域的发展为疫苗开发提供了新的思路和方法，如反向疫苗学或基因组-疫苗设计。虽然这一学科建立至今只有约十年的时间，但已开发出第一个反向疫苗产品—诺华的B型脑膜炎球菌疫苗Bexsero ^R，并即将在欧洲获准上市。反向疫苗学家现在面临的最大困扰是要从全基因组测序提供的海量信息中筛选最佳的免疫原候选物。由细菌病原体组成的抗原数量可能相当大。含有更小基因组的超突变病毒具有的遗传多样性也增加了选择的难度。此外，由于单一物种的遗传多样性也放大了基因组图谱。

“我们需要一种新的疫苗设计方法，来克服传统方式的局限性。”

新兴的基因组序列开发的生物信息学工具“片段库”可被用于通过亚细胞定位，预测或模拟相关病原体的毒力因子来识别潜在的免疫原性蛋白质（如：膜蛋白或分泌蛋白）。结合描述抗原表达丰度和动力学的蛋白组学数据，这些工具大大缩小了抗原候选库，但它们本身并不能为疫苗抗原的选择提供免疫学指导。从这个角度出发， T 细胞表位预测也许是最实用的工具。入侵的病原体释放的T 细胞抗原决定肽可与抗原提呈细胞表面的主要组织相容性复合体分子和T 细胞表面的T 细胞受体结合。这种结合对保护性的继发免疫反应的激活必不可少。 CD8+和CD4+ T细胞在重复暴露后的控制感染和保护机制中发挥重要作用。CD4+ T细胞的响应对健康 CD8+  T 细胞的增殖、发挥功效和分化为记忆细胞至关重要。此外，CD4+  T 细胞的响应协助B 细胞产生抗体，后者介导了所有现售的人用疫苗对机体的保护作用。因此 T细胞表位的预测既可识别病原体来源的序列，后者可作为高效疫苗的抗原，又可识别参与有效体液免疫应答的关键T 细胞表位。此外，由于同源T 细胞有助于改善抗体响应的质量和动力学过程，因此应用T细胞表位预测来识别拥有最多T细胞表位的蛋白质，对筛选全抗原疫苗的抗原候选物很有帮助。我们已开发了以T细胞表位预测为核心的基因组-疫苗策略，可用于识别免疫原和起保护作用的T细胞表位。这种策略不仅可针对微生物特定免疫病原表达谱，只要采取以下步骤，还可广泛应用于任何病原体：应用计算机筛选基因组来识别基因，这些基因可编码具有有效抗原特性（如：分泌、促表达、提呈免疫原性和毒力）的蛋白质。另外我们还可不引入实验偏差，对全开放性阅读框数据集进行分析。我们还运用免疫信息学工具来发现与 MHC 蛋白质结合并提呈给 T 细胞的基因序列。对“超类型”等位基因进行筛选来应对繁复的 MHC 的多样性。在进行个性化疫苗设计时，应考虑到单个个体特定的MHC类型。根据所需保护性免疫力的相关性，可利用抗原表位筛选蛋白质（具有越多的T细胞表位，抗原性越高），或者直接选取抗原表位加载到疫苗上。一旦抗原表位用于接种，就需合成选取序列的抗原肽，并在感染愈后者或接种者身上评价其 MHC 结合力和抗原性。最后可在人源化的小鼠身上设计、合成及评价原型疫苗的免疫原性和有效性。一旦这种表位驱动的疫苗开发成功，由此产生的抗原表位就可以多肽或 DNA 串联体的形式作为疫苗的组份，也可直接制成多表位蛋白质疫苗用于接种。显然，这种设计策略将病原体拆解并仅保留让机体产生免疫所需的最小序列信息，从而去除病原体的具有天然免疫原性的固有佐剂和传播属性。当然佐剂和传播属性最终还是会包含在疫苗产品中，但这种以表位为基础的疫苗设计策略有一个关键的优势就是可以为疫苗选择最佳的佐剂和接种技术。

“新兴的基因组序列开发的生物信息学工具“片段库”可被用于识别潜在的免疫原性蛋白质”。

我们应用基因组-疫苗的设计方法开发了一种幽门螺杆菌疫苗，并在慢性幽门螺杆菌感染致癌且被去除p27 基因的老鼠模型上对其进行评估。运用外基质算法的预测软件筛查幽门螺杆菌 J99和26695个基因组是否含有可与人类/鼠MHC结合的CD4+T 细胞表位。由于人群中MHC的多样性， MHC的类型也千差万别。为了确定能够识别多重 MHC 类型的抗原表位，我们使用了ClustiMer算法，找到了蛋白质中高密度表位的序列分区。通过在被去除 p27基因且感染了鼠改性的幽门螺杆菌株（ SS1株）的小鼠身上进行MHC结合力及T细胞应激测试，我们验证了抗原决定簇预测软件的功效。我们将可与 MHC 结合并存在于SS1株中的免疫反应性抗原决定基加载到多表位的DNA-多肽配方疫苗中，并采用异源性的初免-加强免疫策略进行接种。

对 SS1株感染的小鼠鼻内接种这种多表位疫苗，结果引发了广泛的免疫反应，这些反应从使用IFN- 制剂的酶联免疫吸附法测定结果来看，远比全细菌裂解物（可诱导生成释放抗原决定基的蛋白）引起的免疫反应要广泛得多。这一结果与小鼠鼻内免疫接种后用幽门螺杆菌攻毒的结果类似，但与接种全细菌裂解物的小鼠相比反应明显减弱。到观察期末，各实验组小鼠炎症和胃部细胞损伤的组织病理学指标都较低。

3．在抗原表位选择上出现的新问题

我们一直认为 T 细胞抗原始终存在于机体与传染性病原体之间，可驱动交叉反应T细胞参与免疫接种炎症条件下的免疫失调。所以我们在疫苗配方中去除了这些序列。新的数据表明，人类基因组学已可生动地描绘免疫反应，因此我们当前关于T细胞表位选择的考量也发生变化。胸腺后续发育的调节性 T细胞在抗原提呈的相互作用中发挥重要作用。所以，我们认为应对体内共生体和感染病原体的 T 细胞表位序列进行仔细的研究，同样对我们自身机体也应研究。由于肠道微生物大约包含 3300万个基因，用于排序识别这些T细胞的分子特性的序列数据库存量十分惊人。我们现在开始设计一个全新的计算工具和数据分析方法来应对这个巨大的任务。

4．结论

我们及相关领域已开始应用这种基因组-疫苗设计方法来开发针对病原体的疫苗。基因组学、生物信息学和免疫学的结合扩展了我们的疫苗设计工具箱，这种结合应用至今让我们看到希望，能够针对目前缺乏有效疫苗的病原体找到攻克方法。对这种 T细胞表位驱动的幽门螺杆菌疫苗的理论研究也证实了这种可能性，我们预计微调抗原决定基的选择标准将促进这种表位主体疫苗替代已对人类健康产生巨大影响的传统疫苗。

【Expert Rev Vaccines 2012，11(9): 1031-1033　夏南　译　严家新　校】