博文

狂犬病免疫力检测(4)

已有 207 次阅读 2026-6-26 14:15 |个人分类:狂犬病防治|系统分类:科普集锦

狂犬病免疫力检测(4)

前记:

目前国际上关于狂犬病研究最权威最全面的大型学术专著是《狂犬病：科学基础和管控（RABIES: SCIENTIFIC BASIS OF THE DISEASE AND ITS MANAGEMENT）》，简称《狂犬病(RABIES)》。该书最新版（第４版）已于2020年5月面世。

该书共有22章，其中第13章是《Measures of rabies immunity(狂犬病免疫力检测）》。现将此章的内容全文翻译成中文供参考。

第13章狂犬病免疫力检测(4)

（Measures of rabies immunity）

2 狂犬病血清学方法(1)

(Rabies serology methods)

检测和测定血液中的免疫组分是科研与诊断血清学的根本目标。血清学检测的基本原理在于识别抗体-抗原反应。实现这一目标的方法可从多个维度分类：功能性抗体 - 结合抗体、简单 - 复杂、昂贵- 廉价、快速 - 耗时，以及筛查 - 确证。历史上，功能性血清中和法一直是RABV抗体检测的“金标准”，其关键原因在于，接种疫苗后诱导产生的RABV中和抗体才是抵御感染的保护性力量。然而，随着狂犬病生物制品及实验室检测技术的不断进步，对方法改良及开发可及性检测方法的需求日益增长。因此，深入理解不同方法的技术性能及其本质差异变得愈发重要。为此，本节将介绍现有的各类检测方法，下一节则将探讨方法的适用性及检测方案的选择。

2.1 血清中和试验(Serum neutralization assays)

狂犬病血清中和（ serum neutralization，SN）试验的显著特征在于能够体外检测特异性抗体的中和活性，从而间接反映这些抗体在体内的潜在保护作用。RABV中和试验的技术操作必须使用活病毒，因而需在高级别生物安全实验室内开展。总体而言，此类试验操作繁琐、耗时较长。根据待测样本数量及基础方法的改良情况，SN法既可成本较高或经济高效，也可通量较低或较高，既能用于筛查，亦可作为确证手段。世界卫生组织（WHO）和世界动物卫生组织（OIE）目前认可两种用于测定RVNA的狂犬病SN试验：1973年由Smith等人描述的RFFIT，以及1997年由Cliquet等人开发的FAVN。

SN试验测定RVNA的原理与早期狂犬病血清学工作中广泛应用的小鼠中和试验（MNT）一致。MNT的操作流程为：将系列稀释的待检血清注射入小鼠体内，随后用标准剂量的RABV攻毒，以小鼠死亡率为判定指标（Atanasiu, 1973）。尽管该方法堪称对血清中RVNA保护功能的“真实”测量，但个体小鼠免疫力的生物学差异及其他免疫效应因子的潜在干扰，使其变异性极大，难以标准化。相比之下，RFFIT等体外方法因精密度更高、灵敏度更好而被普遍采用。

RFFIT与FAVN的操作流程均为：将经热灭活的血清进行系列稀释，与固定量的活RABV在37°C下孵育60–90分钟。随后通过在细胞培养体系中借助标记的抗RABV抗体检测残留病毒的感染性，并根据含病毒感染细胞的显微视野数量计算定量效价。经典RFFIT法在多腔室玻片上进行（见图13.2）：血清按5倍梯度稀释，各稀释度分别加入对应孔中。RFFIT的改良版本包括以微孔板替代玻片，以及采用2倍或3倍梯度稀释。RFFIT中使用的RABV攻毒剂量应介于30至100 TCID50（50%组织培养感染剂量）之间。病毒加入稀释后的血清后，玻片于37°C孵育90分钟，随后向每孔加入幼仓鼠肾（BHK）细胞或小鼠神经母细胞瘤（MNA）细胞。部分RFFIT改良方案中会使用浓度为0.01μg/mL的二乙氨基乙基葡聚糖（DEAE-Dextran），以增强细胞对RABV的易感性（Kaplan, Wiktor, Maes, Campbell, & Koprowski, 1967）。玻片通常在含2%–5% CO₂的37°C培养箱中孵育20–24小时；若采用微孔板方案，部分改良方法的孵育时间可延长至48小时。待孔内形成单层贴壁细胞后，洗涤孔板并以80%冷丙酮固定细胞。随后加入FITC标记的、靶向RABV核蛋白（N）的抗RABV抗体，以便在荧光显微镜下识别病毒感染细胞。在8孔腔室玻片中，每孔观察20个视野，依据细胞内是否存在荧光信号进行判定：无荧光提示样本中抗体已中和病毒，有荧光则提示缺乏相应抗体。待分析血清样本的RVNA效价定义为：50%观测视野中出现≥1个感染细胞时的血清稀释度。利用Reed-Muench公式、Spearman-Karber公式或Probit分析法进行数学计算，即可得出血清样本中RVNA的精确定量效价。此外，也可采用简化定义（精度略低）：将出现100%病毒抑制的最高血清稀释度定为RVNA定量效价，即该稀释度下无感染细胞，而所有更高稀释度均可见感染细胞（Aubert, 1996; Habel, 1996）。