一、产品简介：

NADPH氧化酶（NADPH oxidase，NAO）是一个典型的膜蛋白，催化NADPH氧化生成NADP⁺，并将电子传递给氧原子从而产生超氧阴离子。广泛存在于动物、植物和真菌中。该酶异常可导致人慢性肉芽肿病（GCD），在植物中，该酶与其抗病性和各种胁迫有密切关系。

NADPH氧化酶（NAO）将NADPH氧化为NADP⁺的同时生成超氧阴离子(O2 .^- )，接着与显色剂反应生成水溶性的黄色物质。对照通过添加该酶的特异性抑制剂DPI排除背景值。最终检测生成的有色物质在450nm处的吸光值，即可计算得出NAO酶活性大小。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；建议500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清置于冰上待测。

2、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，设定温度37℃，调节波长至450nm。

② 所有试剂解冻至室温（25℃）。

③ 操作表：

3、正式实验：

① 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。

五、结果计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：每毫克组织蛋白每分钟在反应体系中使450nm处吸光值变化0.01为一酶活单位（U）。

NAO(U/mg prot)=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.01÷T=50×ΔA÷Cpr 

2、按样本质量计算：

酶活定义：每克组织每分钟在反应体系中使450nm处吸光值变化0.01为一酶活单位（U）。

NAO(U/g 质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=50×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

酶活定义：每10⁴个细菌或细胞每分钟在反应体系中使450nm处吸光值变化0.01为一酶活单位（U）。

NAO(U /10⁴ cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.01÷T=50×ΔA÷N

V：加入提取液体积，1mL；           V1：加入样本体积，0.02mL；

V2：反应体系总体积，0.2mL；         T：反应时间，20min；                

W：样本质量，g；                    N：细胞或细菌总数，以万计；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。