||
一、产品简介:
一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是一种气态分子自由基,在生物体内作为重要的信使分子和效应分子,参与调节血管形成、神经传递、免疫调控及肿瘤生长等多种生理及病理过程。此外,NO是植物的主要生物活性分子,在植物的生长发育和对胁迫的反应过程中参与了多种生理活动,如种子萌发、叶扩展、根生长、花器官发生、气孔运动的调节以及植物的抗逆反应等。
NO在体内或水溶液中极易氧化生成NO2-。在酸性条件下,NO2-与重氮盐磺酸胺生成重氮化合物,进一步与萘基乙烯基二胺偶合,产物在550nm处有特征吸收峰,测定其吸光值,可以计算NO含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
稀释液 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体3mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体3mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 4℃避光保存 | 临用前加入3mL试剂四,充分混匀。 |
试剂四 | 液体4mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五A | 液体6mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
试剂五B | 液体6mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 液体1mL×1支 | 4℃保存 | 10μmol/mL标准品母液 |
试剂五工作液配制:临用前根据样本数量按照试剂五A:试剂五B=1:1的比例配制显色液,充分混匀,现配现用; |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、超声细胞破碎仪、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、冰和蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.2g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆后,10000g,4℃离心15min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为2~5:10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:建议1000万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔7s,总时间 5min),10000g,4℃离心15min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为1000~2000:1的比例进行提取。
③ 血清(浆)等液体样本:直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。
2、标准溶液的配制:把10μmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成1.25μmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 蒸馏水体积 (μL) | 标准液体积 (μL) | 稀释后浓度 (μmol/mL) |
S1 | 10 | 525 | 75 | 1.25 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至550nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
蒸馏水 | - | - | 100 |
标准溶液 | - | 100 | - |
样本 | 100 | - | - |
试剂一 | 25 | 25 | 25 |
试剂二 | 25 | 25 | 25 |
试剂三 | 25 | 25 | 25 |
充分混匀,室温(25℃)静置5min,于10000g,4℃离心5min,取上清。 | |||
上清液 | 100 | 100 | 100 |
试剂五工作液 | 100 | 100 | 100 |
混匀,25℃静置30min,于550nm处测定各管吸光值,分别记为A测定、A标准和A空白,计算ΔA测定=A测定-A空白,ΔA标准=A标准-A空白。 (注:空白管和标准管只需测1-2次) |
4、正式实验:
① 若预实验∆A 测定小于 0.005,可以增加样本量后再进行测定;如果∆A测定大于1.5,建议将样本上清用稀释液适当稀释后再进行测定,并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、按样本蛋白浓度计算
NO含量(μmol/mg prot)= ΔA测定×(C标÷ΔA标准)×V1÷(V1×Cpr)
= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr
2、按样本质量计算
NO含量(μmol/g 质量)= ΔA测定×(C标÷ΔA标准)×V1÷(W×V1÷V)
=1.25×ΔA测定÷ΔA标准÷W
3、按细菌/细胞数量计算
NO含量(μmol/104 cell)=ΔA测定×(C标÷ΔA标准)×V1÷(V1×N÷V)
=1.25×ΔA测定÷ΔA标准÷N
4、按液体体积计算
NO含量(μmol/mL)= ΔA测定×(C标÷ΔA标准)×V1÷V1
= 1.25×ΔA测定÷ΔA标准
C标:标准管浓度,1.25μmol/mL; V1:加入样本体积,0.1mL;
V:加入提取液体积,1mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;
W:样本质量,g; N:细菌/细胞总数,以104计。
注意事项:
如果样本上清有颜色(在 550nm 下有吸收峰),则需要补测样本的对照管,即将工作液用相同体积的蒸馏水代替。在 550 nm 下测定吸光值 A,分别记为 A 标准、A 测定、A 空白、A 对照,计算 ΔA 标准=A 标准-A 空白,ΔA 测定=A 测定-A 对照。此时试剂盒规格为 100T/48S。
Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )
GMT+8, 2024-6-23 07:45
Powered by ScienceNet.cn
Copyright © 2007- 中国科学报社