一、产品简介：

漆酶（CE1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，漆酶存在菇、菌及植物中，是一种环保型酶，其独特的催化性质在生物检测中有广泛的应用。  漆酶分解底物ABTS产生ABTS自由基，在420nm处的吸光系数远大于底物ABTS，测定ABTS自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、超声波破碎仪、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、冰、蒸馏水。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆，于 4℃下孵育60min。10000g，4℃离心 10min，取上清，置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞，加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率300W，超声3s，间隔7s，总时间 3min）；10000g，4℃离心 10min，取上清，置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(10⁴个):提取液体积（mL)为500~1000:1比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。

2、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min，调节波长至420nm。

② 操作表：

3、正式实验：

① 若测定吸光值超过0.9，请将样本用提取液进行适当的稀释再测定，并将改变后的D代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

①按蛋白浓度计算

酶活定义：每mg蛋白每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

漆酶酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V2×10⁹÷（V1×Cpr）÷T×D=74.07×ΔA÷Cpr×D

②按样本质量计算

酶活定义：每g样本每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

漆酶酶活（U/g 质量）=ΔA÷（ε×d）×V2×10⁹÷（V1×W÷V）÷T×D=74.07×ΔA÷W×D

③按细胞数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

漆酶酶活（U/10⁴cell）=ΔA÷（ε×d）×V2×10⁹÷（细胞数量×V1÷V）÷T×D

=74.07×ΔA÷细胞数量×D

④按液体体积计算

酶活定义：每 mL 液体每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位（U）。

漆酶酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V2×10⁹÷V1÷T×D=74.07×ΔA×D

ε：ABTS 摩尔消光系数：3.6×10⁴L/mol/cm；    d：比色皿光径，1cm；

V2：反应总体积，2×10^-4L；                  V1：反应中样本体积，0.025mL；

V：加入提取液体积，1mL；                  W，样本质量，g；               

T：反应时间，3min；                        细胞数量：以万计；              

D：稀释倍数，未稀释即为1；                10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol。

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。