在生物医学研究和生物制药领域，细胞培养是基础中的基础。支原体是一种无细胞壁的原核生物，尺寸微小，难以通过常规显微镜观察。它们污染细胞后，可能引起染色体变形、代谢紊乱甚至细胞死亡。

培养法是各国药典（如中国药典、欧洲药典）中规定的传统方法，被视为支原体检测的"黄金标准"。其原理是将待测样品接种到支原体专用培养基中，观察支原体是否生长增殖。具体操作中，使用液体、半流体或琼脂培养基，在36°C±1°C下培养21天。期间，需定期观察培养基是否变浑浊或出现典型菌落。

优点：

直接检测活菌，结果可靠，被全球药典认可

灵敏度高，可达10 CFU/mL

缺点：

耗时长，需7+21天，无法满足快速放行需求

操作繁琐，需传代培养 

指示细胞培养法结合了细胞培养和DNA染色技术，能在3-5天给出结果。方法是将待测样品与指示细胞（已证明无支原体污染的Vero细胞或其他传代细胞）共同培养，之后用DNA染料（二苯甲酰胺荧光染料Hoechst 33258）染色。若存在支原体，荧光显微镜下会看到除细胞外，可见大小不等、不规则的荧光着色颗粒。

优点：

时间较短（约3-5天），比培养法快

直观显示支原体在细胞上的附着情况

缺点：

仍需细胞培养步骤，可能受细胞状态影响 

化学发光法是一种基于酶学反应的快速检测方法，通过检测支原体中特有的乙酸激酶和氨基甲酸激酶的活性来进行判断。这些酶在导致95%支原体污染的6个种属和大多数柔膜细菌中均存在，但在真核细胞中不存在。

检测原理：

试剂中的底物与支原体特异性酶反应产生ATP，ATP在荧光素酶催化下产生化学发光信号，通过检测发光强度来判断支原体污染情况。

优点：

检测速度极快，仅需20分钟即可出结果

操作简单，不需要复杂设备

缺点：

灵敏度略低，低水平污染样本需需要2-3天的预培养，否则难以检测

只能检测上清液，检测完整细胞时背景值较高

检测结果受温度影响大，试剂和样品需平衡至室温

核酸扩增技术（如PCR）是近年来兴起的分子检测方法，通过扩增支原体特异性DNA片段实现快速检测。以上海翼和生物的支原体检测试剂盒为例，包括免抽提快检qPCR支原体检测试剂盒（BPM50）和高灵敏度qPCR支原体检测试剂盒（BPMPro50）。这些试剂盒采用TaqMan探针法，覆盖120种常见支原体，简便快捷，灵敏度分别可达100和10 CFU/mL。

优点：

超快速，适合细胞治疗产品等需快速放行的场景

高灵敏度、高特异性，可覆盖120种支原体

缺点：

特异性与覆盖度受引物设计能力限制 

NAT法已被多国药典认可为替代方法。例如，翼和生物的试剂盒已通过第三方验证，专属性、检测限和耐用性均符合标准，性价比高。日常监控中，支原体在培养过程中会快速增殖，即使初始污染量低，PCR也能准确检出。

支原体污染无处不在，但通过科学检测，我们可以提前防控。无论是科研人员还是生物制药从业者，选择合规、验证过的方法至关重要。