在细胞培养中，定期做支原体检测已经成为越来越多实验室的常规操作。但一个常被忽略的问题是：检测结果为阴性，就一定代表没有支原体污染吗？

答案是：不一定。

假阴性的第一个来源：引物设计覆盖盲区

支原体不是单一物种——它是一大类微生物的总称。目前已知的支原体、脲原体、无胆甾原体和螺原体加起来超过200种。这些物种在遗传上差异极大，尤其是保守性相对较低的基因区域。

目前主流的qPCR检测策略通常靶向16S rRNA基因。16S rRNA在大多数细菌中高度保守，但支原体的情况有些特殊：不同支原体物种之间的16S rRNA序列存在较大差异。2023年，法国赛诺菲研究团队在开发自建支原体qPCR方法时发现，莱氏无胆甾原体（Acholeplasma laidlawii）的16S rRNA序列与其他支原体差异极为显著，单一探针根本无法覆盖。他们最终需要设计两条不同的探针——一条用于绝大多数支原体物种，另一条专门用于A. laidlawii——才能在同一个反应中实现全覆盖。

这意味着，如果一套试剂盒的引物/探针设计只考虑了最常见的几种支原体，那么遇到序列差异大的物种时，就可能出现扩增效率低下甚至完全无法检出的情况——这就是假阴性的一个来源。

假阴性的第二个来源：对"非主流"物种的忽略

一项研究曾对多款市售支原体qPCR检测试剂盒进行了对比验证。结果发现，一些市售试剂盒虽然声称能够覆盖欧洲药典指定的全部9种支原体，但在实际测试中，却漏检了某些罕见支原体株——尤其是丝状支原体簇（M. mycoides cluster）的成员。

丝状支原体簇在反刍动物中具有较强致病性，虽然它们不像口腔支原体那样在细胞培养中高频率出现，但一旦通过牛血清或牛源性胰酶等原材料进入培养体系，同样可以存活和增殖。如果此时使用的检测方法恰好不能识别这些物种，结果就是——细胞的培养基中明明有支原体，检测报告却写着"阴性"。

假阴性的第三个来源：PCR抑制物的干扰

除了检测范围本身的问题，另一类常见的假阴性来自于样本自身。

支原体检测的样本通常是细胞培养上清液。这部分样本中含有多种可能抑制PCR反应的成分：胎牛血清中的免疫球蛋白和生长因子、培养基中的高浓度氨基酸和维生素、以及某些细胞代谢产物。此外，如果样本处理不当（例如冻存样本反复冻融导致DNA降解），也会降低可检出的支原体DNA量。

一个好的策略是使用内部阳性对照（Internal Positive Control, IPC）。在反应体系中加入已知量的内参DNA，与目标支原体DNA在同一管中扩增。如果内参信号正常而支原体信号为阴性，结果是可信的；如果内参信号也偏弱或缺失，则提示可能存在PCR抑制——此时阴性结果不能采纳，需要优化样本处理或重新检测。

如何降低假阴性的风险？

综合来看，减少支原体检测假阴性可以从以下几方面入手：

第一，选择检测覆盖范围足够宽的试剂盒。引物探针设计应覆盖更多的支原体物种，而不是只针对最常出现的8到10种。

第二，确认试剂盒包含完善的质控体系。内部阳性对照（IPC）能帮助区分"真的没有污染"和"检测被抑制了"这两种截然不同的情况。

第三，规范样本处理流程。培养上清样本应新鲜检测或规范保存，避免反复冻融导致DNA损失。

第四，在条件允许时采用两种不同原理的方法进行交叉验证。例如qPCR法结合荧光染色法，可以有效降低单一方法因技术限制导致的漏检风险。

定期检测是防控支原体污染的核心手段，但只有"可靠"的检测才能发挥真正的防控作用。了解假阴性的来源，选择经过充分验证的检测方案，才能让每一次阴性结果都经得起推敲。

上海翼和生物支原体qPCR检测试剂盒，采用TaqMan水解探针法，配备内部阳性对照体系，检测范围覆盖120种支原体，灵敏度可达10 CFU/mL。

参考文献：

[1] Carrillo-Ávila JA, García-López M, Aguilar-Quesada R, et al. Development and Evaluation of a New qPCR Assay for the Detection of Mycoplasma in Cell Cultures. Curr Issues Mol Biol. 2023;45(8):6903-6915. doi: 10.3390/cimb45080435.

[2] Dos Santos S, Lespinasse E, Bonnet B, Basmaciogullari S. Simple, specific, rapid, and pharmacopoeia-compliant qPCR approach for the detection of mycoplasma in biopharmaceuticals. Mol Ther Methods Clin Dev. 2025;33(3):101572. doi: 10.1016/j.omtm.2025.101572.

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