甲基化芯片和甲基化测序得出的数据本质上是基于信号强度或读段覆盖度的统计估算。那么，有没有一种方法能够绕过估算，直接对甲基化分子进行“计数”？

答案是数字PCR（digital PCR, dPCR） 。

传统定量PCR（qPCR）依赖标准曲线和Ct值来推算模板浓度，本质上仍然是一种相对定量——结果的准确性高度依赖于标准品的质量和PCR扩增效率的一致性。

数字PCR则完全不同。它将一个PCR反应体系分割成数以万计的微小反应单元（微滴或芯片微孔），每个单元中至多包含一个目标DNA分子。经过扩增后，逐一读取每个单元的荧光信号——有信号的记为“1”，无信号的记为“0”。通过统计阳性单元的比例，结合泊松分布校正，直接计算出目标分子的绝对拷贝数，使得数字PCR能够不依赖标准曲线即可实现核酸分子的绝对定量。当应用于甲基化检测时，数字PCR可以直接给出目标CpG位点甲基化分子的比例。

优势一：超高灵敏度，不错过低丰度信号

在肿瘤液体活检等场景中，循环游离DNA（cfDNA）中甲基化标志物的比例往往极低。传统方法在低浓度样本中灵敏度不足。数字PCR可在总DNA中可靠区分低至1%的甲基化水平，让您不会因为方法学限制而错过有意义的信号。

优势二：绝对定量，结果可溯源

数字PCR输出的是绝对拷贝数和甲基化比例。这种“所见即所得”的数据特性，使得结果在不同实验室、不同批次之间具有更好的可比性和可溯源性。

优势三：高精度与良好的重复性

研究表明，与传统的基于PCR的方法相比，数字PCR在DNA甲基化定量方面提供了更准确、更灵敏的检测手段。在高通量甲基化数据的验证场景中，数字PCR的精准定量能力使其成为理想的选择。

优势四：适用于复杂区域的精准检测

甲基化检测常涉及高GC含量区域、重复序列等复杂模板。数字PCR通过将反应分割为大量微反应单元，有效降低了复杂模板对扩增效率的干扰，在传统方法难以准确检测的区域仍能提供可靠数据。

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验证芯片/测序筛选的差异甲基化位点——对高通量筛选出的候选位点进行精准复测，排除假阳性获得甲基化水平的绝对定量数据——直接输出甲基化比例（%），无需依赖标准曲线检测低丰度甲基化标志物——灵敏检测低至1%的甲基化信号，不错过任何有意义的发现提供完整的实验报告——包含引物探针信息、原始数据、分析结果，满足期刊发表要求

适用场景：

验证甲基化芯片（450K、EPIC）筛选的关键差异甲基化位点

验证甲基化测序（WGBS、RRBS）发现的候选差异甲基化区域（DMR）

临床样本中特定甲基化标志物的精准定量

发表高分论文前的关键数据确认

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