一、什么是TRAP法？

端粒酶重复扩增技术（Telomerase Repeat Amplification Protocol）TRAP法是一种高灵敏的检测方法，用于测定细胞和组织样本中的端粒酶活性。

二、TRAP法如何工作？

TRAP法的核心在于利用端粒酶的生物学特性，通过三步反应实现高灵敏度检测：

端粒酶的作用：端粒酶是一种核糖核蛋白酶，能在染色体末端添加端粒重复序列（如TTAGGG），从而维持端粒长度。在癌细胞中，端粒酶活性异常升高，导致细胞无限增殖。

TRAP法的三步设计：模拟端粒延伸→PCR放大→可视化检测

延伸步骤：端粒酶以非端粒寡核苷酸（TS引物）为底物，在25°C下添加端粒重复序列，形成延伸产物。

扩增步骤：通过PCR放大延伸产物，使用TS上游引物和ACX下游引物，确保特异性扩增。

检测步骤：电泳分析PCR产物，端粒酶活性表现为6-bp阶梯状条带，内部标准（TSNT）用于验证实验可靠性，避免假阴性。也有如ELISA，qPCR等优化方案检测。

三、主要实验步骤

TRAP法的实验流程可分为四个主要阶段，下面展示一个典型方案：

1.细胞裂解物制备​​

收集细胞，离心（3,000 × g，5分钟）后弃上清。

用预冷的NP-40裂解液（10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25 mM 脱氧胆酸钠, 10% 甘油, 150 mM NaCl, 5 mM 2-巯基乙醇, 0.1 mM AEBSF。裂解细胞并提取蛋白质，保持端粒酶活性）重悬细胞沉淀，浓度为2,500个细胞/μl（例如，100,000个细胞用40 μl裂解液）。

冰上孵育30分钟，或液氮速冻后保存于-80°C。

2.PCR反应准备​​

将样品置于冰上。

设置阳性对照（如H1299细胞）并制备系列稀释液（1:10）。

配制TRAP预混液（每50 μl反应体系）：

水：40.2 μl

10x TRAP反应缓冲液（200 mM Tris-HCl (pH 8.3), 15 mM MgCl₂, 630 mM KCl, 0.5% Tween 20, 10 mM EGTA）：5 μl

50x dNTP：1 μl

Cy5-TS引物：1 μl

引物混合物（包含下游引物ACX（100 ng/μl）、内部标准对照TSNT（0.01 attomol/μl）及其反向引物NT（100 ng/μl）。用于PCR扩增和内部标准对照）：1 μl

BSA：0.4 μl

Taq DNA聚合酶：0.4 μl

向49 μl预混液中加入1 μl样品（阴性对照则加入1 μl NP-40裂解液）。

3.PCR扩增​​

延伸：25°C，40分钟。

端粒酶灭活：95°C，5分钟。

PCR循环（24-29个循环）：

95°C，30秒

52°C，30秒

72°C，45秒

恒温：72°C，10分钟。

保存：4°C或-20°C。

4.凝胶电泳与检测​​

向每个样品中加入5 μl上样缓冲液。

配制10%聚丙烯酰胺凝胶。

使用0.5x TBE作为电泳缓冲液，200-220V电压下电泳约2.5小时。

每孔上样25 μl。

使用Typhoon荧光扫描仪（Cy5通道）检测信号。

中国食品药品检定研究院有专家指出，端粒酶活性可以作为判断成瘤性的优良指标。端粒酶活性评估方法主要有两种，直接检测法（TRAP法）与间接检测法（hTERT基因表达定量）。目前市面上已有大量相关试剂盒，大大方便了相关项目的开展。如果追求更简便快捷的检测方案，可选用间接法试剂盒如上海翼和生物端粒酶催化亚基TERT基因表达检测试剂盒，采用双色荧光TaqMan探针法，作为常规分子生物学实验，相较于TRAP法操作简便，快捷。

参考文献：

Mender I, Shay JW. Telomerase Repeated Amplification Protocol (TRAP). Bio Protoc. 2015 Nov 20;5(22):e1657. doi: 10.21769/bioprotoc.1657. PMID: 27182535; PMCID: PMC4863463.