使用Nanopore MinION测序，当电脑跟不上时（如果采用笔记本来测，建议价格在1w以上的），测序会断掉。这时如果保留有fast5文件，还可以救——手动basecalling。

目前，做basecalling的软件有ONT官方提供的Albacore，Nanonet，Guppy和Scrappie，以及非官方的Nanocall(已淘汰，仅在早期的文章中看到)，DeepNano和Chiron。它们之间的比较可参见[1]，另外在人类基因组Nanopore测序文章中也特别比较了Albacore和Scrappie[2]。这些basecalling大多要在不断升级中，各软件间存在一些差异，特别是对poly结构的basecalling。 

       Albacore集成在MinKNOW，因此测序时可作实时的basecalling，它在文章中出现次数最多，也是目前主要的开发热点。可在nanopore官网下载最新版的Albacore，例如：

wget https://apac.oxfordnanoportal.com/software/analysis/ont_albacore-2.3.1-cp35-cp35m-manylinux1_x86_64.whl

下载下来后，需要python3.5环境，如果有安装conda，则方便可以建立一个python3的环境，在这个环境中作后续分析，具体步骤可查看我的另一篇博文[3]，在集群上用以下代码进入python3.5环境

source activate python3

再用以下代码进行安装：

pip3 install ont_albacore-xx.whl

当然conda环境不是必需的，必需的是Python3.5环境。 

安装完成后，用以下-h看一下是否安装成功

基本运行代码如下：

read_fast5_basecaller.py --input /path/to/fast5/dir --recursive --worker_threads 10 --flowcell FLO-MIN106 --kit SQK-LSK108 --save_path /path/to/output

注意：FLO-MIN106这个是flowcell的型号，类似FAH57248这个是flowcell唯一的id，这里--flowcell是FLO-MIN106

另外，如果是混合测序，可添加--barcoding选项，程序会自动搜索barcode；如果想个性化的指定参数，可以提供config文件，再通过--config指定。

# --input指定输入的文件夹，配合--recursive选项，可以只指定最上层目录，程序会自动递归寻找其中的fast5文件

# --worker_threads指定线程数

# --kit的只能在https://nanopore.yilimart.com/Group/Kits1/这里选择现有的试剂盒

# --save_path指定输出的目录

运行完后生成configuration.cfg，pipeline.log，sequencing_summary.txt和workspace文件夹，在workspace文件夹中存放有pass和fail文件夹，里边放的是fastq文件，通常用pass目录下的文件作后续分析。

configuration.cfg记录运行参数，默认min_qscore_1d值为7.0，这个值非常重要，因为它和reads过滤为pass/fail有关，后续有详解；另外还记录有fastq相关文件(夹)命令规则：

[fastq]

identifier = {read_id}

header = {identifier} runid={run_id} read={read_number} ch={channel_id} start_time={start_time_utc}

header_with_barcoding = {identifier} runid={run_id} read={read_number} ch={channel_id} start_time={start_time_utc} barcode={barcode_id}

batch_file_name = fastq_runid_{run_id}_{batch_counter}.{extension}

single_file_name = {read_id}.{extension}

all_file_name = fastq_runid_{run_id}.{extension}

sequencing_summary.txt记录的信息最为全面，这也是目前Nanopore QC软件玩花样的竞技场! 其中的19列内容如下：

注：其中最重要的是mean_qscore_template值 

后续分析建议用pass目录下的read进行。

参考材料：

[1] https://github.com/rrwick/Basecalling-comparison

[2] Miten Jain, Sergey Koren, Karen H Miga. et al. Nanopore sequencing and assembly of a human genome with ultra-long reads. nature biotechnology. 2018. doi:10.1038/nbt.4060

[3] http://blog.sciencenet.cn/blog-2970729-1074395.html