冠状病毒复制体的分子孔道结构

本文为读后感，原文见文后，读后感作者:高小攀

    大多数冠状病毒通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞，正链基因组RNA被释放到细胞质中，基因组RNA被宿主核糖体识别，并翻译成编码NSP的初始病毒多聚蛋白，通过主蛋白酶（M）和木瓜蛋白酶（PLpro）的酶切作用形成16个非结构蛋白，NSP一方面组成转录复制复合体（RTC）。另一方面一方面刺激产生DMV。RTC以基因组RNA为模板合-RNA中间体，-RNA合成新的基因组RNA和mRNA。mRNA被宿主核糖体识别，合成结构蛋白N，M，E 和S蛋白等，其中N蛋白包裹新生成的RNA形成RNP，后与M，E，S结合转运到高尔基体，形成成熟的病毒粒子, 冠状病毒在宿主细胞的细胞质中复制它们的庞大基因组，这一过程是由病毒诱导的转化内质网(ER)膜支持的。病毒通过将宿主细胞膜转化为特殊的双膜囊泡(double-membrane vesicle，DMV)来实现这一功能。病毒诱导产生的双层囊膜结构，RTC被招募到DMV形成了病毒复制的核心，DMV中由双链RNA，主要是病毒基因组复制的中间体和mRNA. DMV提供了病毒基因组合成的场所，免于机体对于双链RNA的免疫监视。病毒基因组是否需要穿越DMV然后和胞质中的N蛋白形成RNP参与病毒的组装。然而这一机制不明。到目前为止，在DMV复制室中还没有检测到对细胞质的开口。

    本研究以冠状病毒的良好模型-小鼠肝炎病毒（MHV）为研究对象，研究者借助低温电镜断层扫描技术对MHV感染细胞超微结构进行了原位观察，发现感染细胞核周有大量病毒双层囊泡，有些与内质网相连形成囊泡网络。双层囊泡管腔主要含有丝状结构，可能与病毒核酸相连，双层膜结构还包含多个跨膜分子复合体。在SARS-CoV-2感染细胞中也观察到类似的结构。因此研究者推测这种孔道结构可能普遍存在于冠状病毒中发挥关键作用，可能是形合成的RNA的穿越胞质的通道。在MHV诱导的DMVs中，双跨膜复合物的平均断层图显示了整体的6倍对称。细胞质王冠样结构在细胞质中延伸~ 13nm，嵌入DMV内膜部分为11nm。该复合体合体形成了一条沿着六重轴线的通道。这个通道内腔约6nm宽，通往胞质部分逐渐变窄，约2-3nm.形成RNA的穿越通道，在胞质部分形成6聚体的王冠结构。分子量大约1.2M。然后研究人员考虑了这个复合体的可能成分。冠状病毒16种非结构蛋白(nsps)中，其中3个nsp是跨膜蛋白，因此可能成为孔的组成部分：nsp3 (222 kDa MHV)、nsp4 (56 kDa)和nsp6 (33 kDa)。 这些nsps相互作用被认为驱动了DMV的形成。根据其大小，多域MHV nsp3亚基是这个孔道的组成部分。MHV nsp3由一个大的约160 kDa的胞质区和两个TMDs和一个约41 kDa的c端胞质区组成。几个nsp3结构域，包括保守的N末端泛素样结构域，它结合单链(ss) RNA和N蛋白。为了验证这一假设，作者通过将EGFP融合到NSP3的N端泛素样结构域，替换了NSP2的基因（nsp2对病毒复制是非必须的），发现EGFP存在于膜孔刺突上，证实了nsp3参与冠状结构形成，6个胞质中的NSP3形成1.2M的王冠样结构，根据以上研究结果，作者提出了DMV参与RNA输出的模型。DNV中核酸通过分子孔到输出到胞质中，只有+链RNA才能运输，-链RNA模板和双链RNA依然在DMV中， RNA一旦输出，胞质中N蛋白包裹RNA，形成RNP. C，胞质中RNP转运到病毒组装膜位点高尔基体，与M,E,S等进行病毒粒子的组装。

原文网址：

https://science.sciencemag.org/content/369/6509/1395.full