GelMA水凝胶实现树突状免疫细胞的高质量培养

126 Photocurable Hydrogel Substrate—Better Potential Substitute on Bone-Marrow.pdf

树突状细胞（DC）被称为“天然佐剂”，是体内最有效的抗原提呈和抗原传递细胞。研究发现，体外小鼠骨髓诱导而来的树突状细胞（BMDC）回输对心肌梗死、病原体微生物导致的败血症和小鼠Sjögren样疾病有治疗作用。近几十年来，DC疫苗作为新开发的、有前途的抗癌疗法的试验已经展开，抗原负载的DC用于各种肿瘤（如肺癌、转移性鼻咽癌、转移性乳腺癌、肝细胞癌和前列腺癌）的临床试验，促进抗原提呈从而增强CD4⁺和/或CD8⁺细胞毒性T细胞反应。DCs在疾病机理研究和药物应用中具有重要意义，所以优化BMDC体外诱导培养条件具有关键作用。

对原代细胞（如BMDC）的研究比细胞系的功能研究更能反映机体内部状态下细胞的功能。然而，在培养皿表面诱导和培养的BMDC不仅难以转染，而且在培养过程中容易被激活，与小鼠体内DC如脾脏DC相比，它们的生物学特性也存在差异。因此，寻找培养皿的替代品，探索如何在体外更好地诱导和培养BMDC具有重要意义。

作为具有固有生物相容性的基础材料，甲基丙烯酸化明胶（GelMA，EFL-GM系列）是一种化学改性明胶，也是一种变性形式的胶原蛋白，具有良好的成型性和机械性能。在组织工程的各个领域，包括心脏、骨骼和血管化以及肿瘤微环境模型的开发中均显示出了应用前景。同时，GelMA能与一系列细胞类型相容进行培养。尽管研究表明GelMA水凝胶培养人类单核细胞可促使其肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌受到抑制²¹。有没有可能基于GelMA水凝胶发展高效的DC细胞培养方法？

浙江大学医学院附属第二医院项美香主任团队与浙大贺永教授团队合作，发展了基于水凝胶的免疫细胞培养方法，能有效避免培养皿培养时DC细胞被激活，导致失效问题。相关工作“Photocurable Hydrogel Substrate—Better Potential Substitute on Bone-Marrow-Derived Dendritic Cells Culturing”发表在Materials杂志，邓婕文博士为第一作者，项美香主任及贺永教授为通讯作者。

在GelMA水凝胶上培养BMDCs 7天后，用特殊的裂解液溶解EFL-GM30并收集细胞，发现在5%的EFL-GM30上培养的细胞可以正常存活，显微镜下观察结果显示无显著差异。与用3%、7.5%的EFL-GM30培养诱导的BMDC组相比，计数发现5%GelMA培养得到的总细胞数最多（e）。流式抗体标记细胞的凋亡分子7AAD在流式细胞分析仪上监测分析发现5%GelMA培养的细胞中细胞死亡细胞率最低（f），且与常规培养BMDC的死亡细胞率无明显差别（g）。因此，DC细胞可以在5%的GelMA-30上存活，死细胞率较低，5%的GelMA-30是BMDC培养的最合适浓度和硬度。

其次，在培养第七天收集常规塑料板培养和5%GelMA培养的BMDC，测试并比较了不同培养基培养得到的BMDC和脾脏DC共刺激分子的表达水平（a，c）。将脾脏DC获得的数据作为对照，5% EFL-GM30组数值比上脾脏DC组数值，共刺激分子（Iab、CD80、CD86、CD40）的比值接近1（b，d）。上述试验结果表明，在5% EFL-GM30培养的BMDC细胞表面上，共刺激分子的低表达水平更接近体内脾脏DC的表型，且BMDC在LPS刺激成熟后，其共刺激分子表达显著增强（e）。

理论上，DC能够呈现抗原并促进T细胞增殖，CD25和CD69表达的增加是T细胞活化的标志。因此，BMDC与CD4+T细胞共培养用于T细胞增殖实验。在非刺激状态下，EFL-GM30组中由水凝胶培养刺激的BMDC的CD4+T细胞的增殖和激活水平接近脾脏DC组（a）。此外，图12显示，5% EFL-GM30培养组/脾脏DCs组特异性CD4+T细胞增殖百分比接近1，说明CCHS在静息状态下对BMDC的作用可能与脾脏DC的作用有关。在LPS刺激后，GM30组共刺激分子（CD40+和CD86+）的活化群体增长最明显，这导致CD4+T细胞的增殖率变化最大（c1，c2），表达CD25和CD69的活化T细胞群体比例最高（d，e）。换言之，CCHS诱导的BMDC在LPS刺激下成熟后更能触发T细胞反应。总之，LPS刺激也可以激活CCHS方法得到的BMDC，使其成熟具备更强的抗原提呈能力从而更好促进T细胞免疫反应，这有助于DC-T细胞免疫治疗的发展。

小鼠DC亚群包括IRF8依赖的常规（c）DC1、IRF4依赖的cDC2和单核细胞衍生的DC。在树突状细胞的分化和发育过程中，cDC1表达高水平的干扰素调节因子8（IRF8），并依赖IRF8、碱性亮氨酸拉链ATF样转录因子3（Batf3）、DNA结合2（ID2）、核因子白细胞介素3调节因子（Nfil3）和B细胞淋巴瘤6（Bcl6）进行发育，cDC2s表达干扰素调节因子4（IRF4）和IRF8，但其表达水平低于cDC1s细胞。因此，使用qPCR检测和分析了水凝胶与培养皿培养的BMDC和脾脏DC中DC发育相关因子的转录水平。结果表明，在5%GelMA-30培养的BMDC和脾脏DC中的IRF4、IRF8和Batf3转录水平没有显著差异，但在培养皿上培养的BMDC的这些发育相关因子转录水平更高（d）。因此，水凝胶培养的BMDC的功能表型和发育状态与脾脏DCs组更接近，这进一步证明了GelMA-30（EFL-GM-30）具有适当的硬度和良好的生物相容性，可以出色地解决BMDC培养过程中的易激活问题。

论文信息：Materials 2022, 15, 3322，DOI： https://doi.org/10.3390/ma15093322