Nature Communications：原位生物3D打印及其“生物混凝土”墨水

In situ 3D bioprinting with bioconcrete bioink.pdf

原位生物3D打印融合了手术机器人及生物3D打印技术，根据患者组织缺损处的形态，直接在缺损处沉积治疗用生物墨水，实现组织再生及修复。原位生物3D打印有诸多优势，由于应用场景的变化，其与常规生物3D打印相比增加了很多苛刻要求：

l  打印端环境多变：原位打印场景中，打印过程可能发生在战场、救灾等环境多变场合，要求墨水流变学性能稳定，当打印环境发生从低温到高温的大温度范围变化时不影响打印性能；

l  修复处血水等影响：墨水要能在较高的体温及充满血水的浸润环境下保持结构不坍塌、打印的细胞能高效存活，并快速功能化以尽快起损伤修复作用；

l  快速功能化：相比于常规生物3D打印中可以通过长时间灌流进行功能化，原位打印需要打印出的组织能快速发挥急救功能，如何让打印组织快速功能化是亟需解决的问题；

l  优异的粘附性能：打印结构需与缺损组织间形成一定的结合力，防止其在体内修复中脱离缺损，造成二次损伤；

l  急性救治便携性：墨水适合放入急救包中野外携带，用于军事、消防等高危领域的紧急救助。

混凝土通过石子被水泥的浸润赋予其良好的可打印性及强度，也是建筑3D打印常用材料。受混凝土启发，浙江大学机械工程学院贺永教授团队（EFL团队），提出了全新的“生物混凝土”墨水思路：将预功能化的载细胞微球作为“石子”，高浓度GelMA水凝胶预聚液作为“水泥”，并开发了机器人原位生物3D打印系统，实现了对不规则创伤的原位修复。

与常规生物墨水相比，“生物混凝土”墨水具有如下特点：

n  墨水中的低强度细胞微球与高浓度水凝胶打印后在微观上类似一系列微球+弹簧，局部低模量，整体高模量，兼具细胞发育及打印结构形状维持能力；

n  墨水不是直接使用细胞做原材料，而是经过了培养并具有微组织功能的细胞球，打印后能更快地在受损位置发挥作用，加速组织修复；

n  墨水对温度变化具有良好的流变学稳定性，在4-37 ℃范围内均可原位打印；

n  由于墨水主体为稳定固化的水凝胶微球，其沉积于血水环境中也能维持3D形态；

n  得益于水凝胶预聚液对缺损组织表面的浸润及氢键作用，打印结构的粘附性好；

n  墨水可通过液氮冻存携带到野外，有望用于战场、救灾等恶劣环境下急性救治。

相关研究“In situ 3D bioprinting with bioconcrete bioink”发表在Nature Communications期刊上，浙江大学机械工程学院贺永教授为该论文通讯作者，谢明君博士、史洋博士为该论文的共同第一作者，该工作得到了浙江大学附属口腔医院谢志坚院长团队的大力支持，特此表示感谢。

图1. “生物混凝土”墨水的设计思路及使用方式

为了验证“生物混凝土”墨水在原位打印场景中的适应性，研究人员分别从墨水的流变鲁棒性、原位可打印性、复合力学特性、打印体/组织结合力、体内修复能力进行了表征，并设计了紧急救援包使该墨水体系更加便携。

流变鲁棒性：与晶体具有固定的熔点（凝固点）不同，明胶等温敏型生物墨水基质材料的溶胶/凝胶状态受温度影响极大，这就使其流变性能易受温度的影响。在流变学表征中，“生物混凝土”墨水呈现Bingham流体特性，并且由于水凝胶微球在墨水体系中的主体地位，使其对大范围的温度变化（4-37 ℃）具有高度的鲁棒性，可适应原位打印场景复杂多变的环境情况。

图2. “生物混凝土”墨水的流变鲁棒性

原位可打印性：“生物混凝土”墨水可在挤出端处于低温、中温、高温环境中时形成均匀的挤出纤维。同时，在沉积端可以发现，即便传统墨水在合适的挤出打印温度中被挤出，但由于接收平台的温度过高且充满“血水”，其迅速过度溶胶化并转变成一汪液体，丧失了3D结构。而“生物混凝土”墨水由于其主体为稳定光交联的微球，即便在温度较高和充满“血水”的接收环境中，其依然能够维持良好的3D结构。这证明“生物混凝土”墨水能够在原位打印中自适应患者损伤处的复杂环境。

打印体/组织结合力：“生物混凝土”墨水中的“水泥”成分可浸润缺损组织的微小缝隙，光交联后可与缺损处组织形成更大的摩擦力，并在氢键作用下形成较强的组织结合力，防止打印体脱离患处。

图3. 原位可打印性及打印体/组织结合力

复合力学性能：力学测试与仿真分析结果表明，“生物混凝土”墨水中的低强度水凝胶微球与高浓度GelMA预聚液固化后形成的高强度网络解决了生物相容性和力学性能间的矛盾，证实了其在原位打印中的力学适应性。

图4. 固化的“生物混凝土”墨水复合力学性能测试及仿真分析

组织修复能力：由于“石子”相是预功能化的细胞微球，打印到创伤位置后有很好的活性，并能快速功能化，4周即可实现大鼠颅骨的有效修复。

图5. 载细胞“石子”的体外存活、伸展、功能化测试

图6. 对颅骨缺损的体内修复能力

便携性：为“生物混凝土”墨水设计了便携方案，紧急救援包内包括装载“石子”组分及“水泥”组分的保温杯及液氮、移动电源、USB加热垫、无菌注射器、3D打印喷头、试剂勺、纸巾等，结合小型机器人打印系统或手动打印模式即可在野外快速进行原位修复手术，使其在未来适用于多场景的现场紧急救援工作。

图7. 装载“生物混凝土”墨水的紧急救援包

除此之外，实际的临床案例中患者的组织缺损可由多种原因引起，因而由事故造成的缺损结构形态及尺寸大相径庭。为了验证“生物混凝土”墨水对于不同组织缺损结构的原位打印及修复能力，设置了四种具有不同形状、不同大小的颅骨缺损大鼠“患者”模型（近似“长方形”、“正方形”、“梯形”、“三角形”为底面的拉伸体缺损模型），作为四名具有不同颅骨损伤形态并需要原位打印修复的“患者”。

原位打印平台选用机械臂系统，并将注射泵系统夹持于该机械臂上以实现墨水的恒流量供应。原位打印喷头选用锥形塑料喷头。根据大鼠“患者”不同的颅骨缺损3D结构，在“患者”缺损处进行原位打印。待打印结束后，利用405 nm蓝光手电筒对墨水进行光固化，最后将“患者”伤口缝合并对伤口消毒。实验结果表明“生物混凝土”墨水在各“患者”的原位修复中具有高度可行性及修复能力。

图8. 利用“生物混凝土”墨水及机械臂对不同颅骨缺损形态的大鼠“患者”进行原位修复

致谢：本研究受到了国家重点研发变革性专项（2018YFA0703000）、国家自然科学基金联合基金重点（U1909218）及国家自然科学基金创新群体（T2121004）项目支持。

全文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-30997-y