生物水凝胶微结构快速制造方法助力心肌细胞定向可控生长

131 Rapid and mass manufacturing of soft hydrogel microstructures__for cell patt.pdf

生物水凝胶上的微/纳米结构广泛用于诱导细胞图案化。传统的光刻技术制造模具既耗时又昂贵，并且由于生物水凝胶软脆的特性，过大的脱模力还极易导致微结构损坏。近期，EFL团队与药学院王毅教授合作提出了一种快速批量制造细胞图案的新方法，使用高精度3D打印模具，通过揭示热-光交联固化机制，实现低浓度-低取代率的GelMA水凝胶微结构高质高效制造。利用该方法，可以稳定且低成本地制造特征尺寸为6-80μm任意定制的水凝胶图案。在超软水凝胶及高精度微结构的支持下，心肌细胞可实现每分钟216次（BPM）的持续自发搏动，接近大鼠心脏的自然搏动速率（300 BPM）。这项工作为细胞图案化提供了一个通用方案，能广泛应用于组织修复、药物测试筛选等领域。相关工作“Rapid and mass manufacturing of soft hydrogel microstructures for cell patterns assisted by 3D printing”近期发表在Bio-Design and Manufacturing杂志上，浙大机械学院何超凡博士生与浙大药学院王雪纯博士为共同一作，浙大机械学院的贺永教授和药学院的王毅教授为共同通讯作者。

材料与细胞的相互作用是组织工程和再生医学的研究热点之一。除了生化特性，材料表面的拓扑结构对细胞行为也有重要影响。许多研究表明，接近细胞大小的微/纳米结构对细胞具有“接触引导”效应，即细胞的生长方向与该结构趋于一致，这一效应已在许多细胞中得到验证。然而，现有的细胞-基质相互作用研究大多基于生物相容性较差的材料，如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、硅、石英等，其主要原因是高效高质制造软脆水凝胶微结构仍然是一个很大的挑战，低浓度-低取代率的水凝胶更是如此。本文采用高精度DLP打印工艺制造了超精密结构的模具，并翻模出软的PDMS模具，与光刻技术相比设计灵活性及效率有较大提升。将GelMA溶液浇铸在模具上进行热-光交联，与光交联GelMA (PGelMA)相比，热光交联GelMA (TPGelMA)在保持良好的生物相容性、降解性和可调性的同时，更有弹性。其核心的机制是随着温度的降低，三螺旋结构（THS）的部分恢复会导致GelMA的溶液-凝胶化转变。热光交联的凝胶TPGelMA，其力学性能的提高能大幅降低脱模过程中微结构的破坏。

图1 软脆水凝胶微结构制造方法

       为验证三螺旋结构（THS）对GelMA水凝胶性能的影响，比较了EFL-GM30、GM60、GM90三种典型取代率GelMA的CD光谱。这三条线在198 nm附近都有一个负峰，与胶原蛋白类似。峰幅值随着取代率的增加而减小，说明MA基团的引入破坏了明胶链上原有的氨基酸序列，阻碍了THS的形成。GM30在不同温度下的CD光谱也显示，随着温度的降低，促进了THS的形成。FTIR分析显示，TPGelMA光谱的峰值更高，频率也发生了显著变化，这与氢键数量的增加密切相关。在机械强度方面，TPGelMA的杨氏模量和抗拉强度均明显高于PGelMA。随着取代率的增加，强度增加比逐渐降低，说明MA基团的引入阻碍了THS的形成，这与CD光谱的结果一致。两种GelMA在不同溶剂中的体积变化率也不同。结果表明，TPGelMA在去离子水、PBS溶液和75%乙醇溶液中的体积变化明显小于PGelMA，表明TPGelMA的分子网络更致密。

图2 热-光交联水凝胶的性能

水凝胶潮湿、软脆的特性使其力学数据难以准确测量。到目前为止，对水凝胶力学性能的研究大多仅限于压缩试验上。为解决这一问题，我们设计了一系列实验方案，以准确获取水凝胶拉伸、压缩、剪切、黏附等各种力学数据。并在此基础上，建立了水凝胶在脱模过程中的粘附和损伤模型。拉伸试验结果表明，TPGelMA的杨氏模量、抗拉强度和断裂伸长率显著提高。当应变达到200%后，应力-应变曲线斜率明显增大，为“应变硬化”效应。这种现象并没有发生在PGelMA中。在整个拉伸过程中，PGelMA的应力-应变曲线始终是线性的。这可能是因为其分子网络比较松散，在分子链取向趋于一致之前就断裂了。在剪切实验中，TPGelMA也表现出更好的力学性能。而在粘附实验中，TPGelMA的粘附强度虽然也有所增加，但增加幅度远低于拉伸和剪切强度的增加幅度，这也是TPGelMA能避免脱模损伤的重要原因。

图3 水凝胶机械性能测试方案与损伤模型

我们设计了平行凹槽、封闭圆环、曲线、分叉血管和10um-5mm的跨尺度结构以验证制备方案的可行性。结果表明TPGelMA的制作完整，而PGelMA上的微结构受损严重，难以分辨。在一个PDMS模具上反复多次脱模后模具上没有残留。因此，该方案脱模后无需清洗，大大缩短了工艺流程。为了对工艺窗口进行全面分析，选择力学性能依次提高但生物性能降低的GM30 ~ GM5M进行脱模试验。结果表明，TPGelMA在最低浓度，结构复杂度，深宽比三个方面的工作窗口都明显拓宽。

图4 水凝胶微结构的制造

热光交联可以最大程度地保持明胶基水凝胶的生物相容性，同时提高其机械强度。这是因为胶原蛋白分子链上的细胞粘附位点没有被破坏。为了验证这一点，将心肌细胞、肌腱干细胞和成纤维细胞接种于PGelMA和TPGelMA上，并在第3天进行活死分析。结果表明，不同的细胞对两种水凝胶均有良好的生物活性。为了验证微图纹水凝胶对细胞的接触引导作用，用肌腱干细胞构建了平行条纹图，用心肌细胞构建了环形图。可以看到细胞按照设计的图案排列，细胞骨架也沿着微结构的方向生长。而脱模失败的水凝胶则很难使细胞形成图案。

图5 生物相容性和细胞图案化效果

在水凝胶上的细胞图案更符合体内微环境。分析心肌细胞的跳动及功能蛋白表达。对照组心肌细胞无序生长，随机分布，细胞之间的连接也非常混乱。相比之下，实验组心肌细胞排列更有规律，扫描电子显微镜也清楚地显示，细胞连接形成一个更有序的网络。利用视频分析软件ImageJ对心肌细胞的跳动进行分析，发现对照组的跳动速度为24 BPM，比机体的跳动速度慢一个数量级。实验组心肌细胞的搏动速度为216 BPM。实验组不仅细胞的搏动速度提高了10倍，而且搏动一致性提高了很多。对照组细胞收缩时间、峰-峰时间、峰间时间、松弛时间更长。而且数据的标准差很大，说明细胞跳动的规律性很差。在实验组中，细胞跳动数据的标准差降低为十分之一左右。这表明，细胞不仅跳动得更快，而且跳动得更有规律。肌节α肌动蛋白染色分析显示，图案化心肌细胞具有肌节结构，随细胞纵向分布，这更符合生物体的实际情况。相比之下，对照组的肌动蛋白是无序的。这表明图案心肌细胞在结构和功能上更接近生物体的真实状态，对理解细胞行为和构建人工生物组织具有重要的启发意义。软脆水凝胶微结构制备方法在组织工程和再生医学领域具有重要的潜力，为仿生组织、芯片上器官、细胞行为学和微流体提供了一个通用的平台。

图6 图案化细胞的功能性

原文链接：https://link.springer.com/article/10.1007/s42242-022-00207-1